扫描电镜及其制样技术.

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1、扫 描 电 镜 技 术 Techniques of Scanning Electron Microscope 一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术 （一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法 扫 描 电 镜 技 术 扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种 电镜，用于观察物质表面及断面的三维形 貌结构和进行微区成分分析。 一、扫描电镜的基本结构 与成像原理 1、 SEM基本结构及其作用 （）电子光学系统 电子枪：阴极、阳极、栅极 。 阴极通电加热后产生电子 束。 阳

2、极加速电子束。 栅极控制和会聚电子束流 。 电磁透镜：会聚电子束，形 成直径510纳米的电子束（即 电子探针），照射于样品上 。 图1-1 扫描电镜工作原理图 （）检测系统 二次电子的来源及作用 l在样品表面以下几纳米到几十纳米的区 域，被入射电子（初级电子、一次电子 ）所激发出来的样品原子中的外层电子 ，称谓二次电子（次级电子）。 lSEM通常是由二次电子所形成的图象来 显示生物样品的表面形貌。 （）检测系统 二次电子检测系统 的组成及作用 l组成：检测器（二 次电子探头）、光 电倍增管、视频放 大器。 l作用：对二次电子 进行收集、放大和 处理，以调制显像 管栅极电压并成象 。 图1-1

3、扫描电镜工作原理图 （）电子偏转系统（扫描系统 ） l组成：扫描发生 器、扫描线圈。 l作用：使镜筒和 显像管内的电子 束分别进行同步 光栅状扫描，最 后在显像管的荧 光屏上显示出完 整图象。 图1-1 扫描电镜工作原理图 2、影响图象形成的因素 （1）倾斜角效应 二次电子成像原理 二次电子产率主要取决于电子 束的入射角，而入射角又主要取 决于样品的倾斜程度。 样品的倾斜角效应是影响图象 反差的主要因素。 SEM图象的反差主要是由样品 表面的凹凸状态决定的，越是凸 出的部位产生二次电子的数量越 多，图象越明亮，反之则较暗。 图1-2 样品倾斜对二次电子产率的影响 2、影响图象形成的因素 （2）

4、原子序数效应 l原子序数效应：样品内原子序数不同的元 素，在图象上也会形成一定的亮度差异， 这种现象称为原子序数效应。 l对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀 一层原子序数高的金属膜，可提高图象质 量。 2、影响图象形成的因素 （3）充放电效应 l充电：当初级电子轰击干燥的生 物样品表面时，会因其导电性能 差而发生电荷积累的充电现象， 并对随后到来的初级电子产生排 斥，使电子散开，且导致二次电 子发射轨迹偏斜或杂乱。 l放电：轰击区内电子堆积，与邻 近区域间产生电位差，则可产生 放电打火现象。 l充放电效应：上述充、放电状况 造成图象忽明忽暗或模糊不清等 现象，称为充放电效应。 l对策：采用金

5、属镀膜、导电胶粘 贴样品等导电处理，可减少充放 电效应的影响。 图1-4 血细胞充放电效应图例 二、扫描电镜的特点 （一） 图 谱 （二）扫描电镜的特点 l观察表面形貌。 l图象景深大，富有立体感。 l放大范围广，分辨率较高：放大倍数为 数10倍数10万倍；分辨率取决于电子探针的 直径，一般为510 nm。 l可观察块状样品： 0.510cm3。 l样品制备简单。 l可结合元素分析。 三、扫描电镜生物样品制备技术 （一）样品的常规制备方法 取材 清洗 固定 清洗 脱水 干燥 金属镀膜 SEM观察 1、取样 l取样部位要准确。 l取样大小要适当：常为1cm3。 l取样操作要轻巧快捷：取样要快，严

6、防对 样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态 。 l样品的基底部应切割平整（以便于样品 粘贴），观察面应作好识别标记。 2、清洗 （1）清洗的目的： 充分暴露样品观察面的表面特征。 （2）清洗液的选择 l常规洗液生理盐水、PBS等缓冲液； l特殊洗液低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆 盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组 织等）的初级清洗。 （3）清洗的方法 l 浸泡清洗。 l 震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜 等），可利用震荡器进行震荡清洗。 l 离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗 。 （4）清洗的要求 l样品要清洗干净：换液数次，可在解剖

7、镜下检查，直至干 净，以充分暴露表面特征。 3、固定 （1）固定的目的 l 保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活 状 态。 l 使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受 表 面张力变化的能力。 l 提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。 （2）常用的固定剂 l 戊二醛：常用浓度为14%。 l 锇酸：一般用12%浓度。 （3）固定的方法 l 先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清 洗后，再用锇酸固定3060分钟。 4、脱水 （1）脱水的目的 用低表面张力且易挥发的有机溶剂（ 乙醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水 ，使样品在后续干燥处理时的表面张力减 少。 表1 几种液体

8、的表面张力 单位：达因/cm 液 体 乙 醇 丙 酮 水 表面张力 16.49（20） 2 1.16（40） 70.61 (20） （2）脱水的方法 lPBS清洗3次，510min/ 次 乙醇梯度脱水 到纯乙醇，530min/级。 （3）脱水的要求 l脱水要彻底； l严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终 保持样品润湿，以免因表面张力变化而造成 样品的皱缩、塌陷或变形。 5、干燥 （1）干燥的目的 彻底去除样品中的脱水剂，使样品 干 燥，以保护镜筒高真空和样品不变 形。 （2）干燥的方法 l1）空气干燥法 l2）真空干燥法 l3）冷冻干燥法 l4）临界点干燥法 （2）干燥的方法 1）空气干燥法

9、 l 方法：把样品放在空气中，让其中的脱水 剂自然挥发掉，以达到干燥的目的 。 l 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许 多样品发生变形或收缩，故本法是 在缺乏其他条件下不得已采用的干 燥方法。 （2）干燥的方法 2）真空干燥法 l 方法：在真空的条件下使样品中的脱水 剂 挥发掉。 l 特点：效果与空气干燥时相同，仅是干 燥 的速度较快。 （2）干燥的方法 3）冷冻干燥法 特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面， 所以由表面张力引起的样品变形和损 伤大为减少，因此干燥效果较好。 缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。 图3-1 冷冻干燥法技术流程 （2）干燥的方法 4）临界点干燥法 临界点干燥的原

10、理（图3-2） 图3-2 临界点干燥原理图 临界点干燥的原理之小结 l临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定 的温度（临界温度）。 l临界状态的特性：气、液密度相等，相界消失；液 体变成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加 多大的压力，气体不会变成液体。 l临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除 的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。 临界干燥液的选择置换液与中间液 置换液：在临界点干燥器内起临界干燥 作用的液体称为置换液(表2)。 表2 某些液体的临界特性 中间液：醋酸异戊酯 名 称 水 乙醇 氟里昂 液体CO2 临界温度() 374 243 28.9 31.5 临界压力

11、(kg/cm2) 218.5 63 38 72.8 临界点干燥器的主要结构（图3-3 ） 图3-3 HCP-2型临界点干燥器 临界点干燥的操作程序 取样固 定脱 水醋酸异戊酯 样品入室 注入液体CO2置 换气 化放气取样 (1530 min或过夜） ( 010 ) (010) (1520) (3540) ( 3540 ) (1020 min) (510 min) (30 min) 图3-4 临界点干燥过程 6、粘样（样品的粘贴） （1）目的：将样品粘牢在样品台上。 （2）粘样材料 l 双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒 状的样品。 l 导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成 的 糊状物，用于粘贴基

12、底部不平 整的样品。 7、金属镀膜 在样品表面喷镀一层厚约330nm的金属薄膜 。 （1）镀膜的目的 提高样品表面的导电性。 提高二次电子发射率。 减少电子束对样品的损伤。 （2）镀膜材料的选择 金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。 （3）镀膜的方法 目前常用离子溅射法镀膜。 7、金属镀膜 1）离子溅射法 离子溅射仪的主要结构 离子溅射镀膜的原理 辉光放电 离子溅射 漫散射镀膜 镀膜厚度的控制： 溅射时间的选择 8、电镜观察 图3-6 离子溅射仪及原理图 （二）特殊样品的常规制备方法 1、游离细胞的制样方法 （1）将盖玻片洗净灭菌，样品面做标记； （2）将盖玻片垂直浸入热溶的25%明胶后即刻 垂

13、直取出，用滤纸吸去边缘多余的明胶； （3）将盖玻片的样品面朝上平放在滤纸上，于 37干燥箱烘干后备用； （4）在盖玻片样品面上滴12滴细胞悬浮液，静 置 20min左右，用滤纸吸去表面残存的悬浮液 。 （5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。 （6）常规方法脱水、临界点干燥、粘样和镀膜。 SEM样品的常规制备方法 小 结 1、SEM样品的常规制备步骤 取材 清洗 固定 清洗 脱水 中间液替代脱水剂 临界点干燥 粘样 （金属）镀膜 SEM观察 2、SEM样品制备的基本要求与原则 （1）样品观察面要处理干净，以充分暴露表 面特征； （2）保护样品观察面，以保持原状不变形； （3）样品要彻底干燥，以保护镜筒的高真空 和样品的形态结构； （4）样品要作导电处理，以减少充放电效应 和提高二次电子发射率。 复 习 题 1、扫描电镜的特点 2、临界点干燥的原理 3、金属镀膜的目的 4、 SEM样品的常规制备步骤 5、 SEM样品制备的基本要求与原则