棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化

《棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化（140页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 分类号： S332.2 单位代码： 10335 密 级： 学 号： 10516008 博博 士士 学学 位位 论论 文文 棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化 棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化 作者姓名 张海平 作者姓名 张海平 指导教师 王学德 教授 指导教师 王学德 教授 学科(专业) 作物遗传育种 学科(专业) 作物遗传育种 所在学院 农业与生物技术学院 所在学院 农业与生物技术学院 提交日期 2008 年 10 月 提交日期 2008 年 10 月 中国 杭州中国 杭州 棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化 棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化 论文作者签名:论文

2、作者签名: 指导教师签名: 指导教师签名: 论文评阅人： 隐名评阅 答辩委员会主席：张国平 教授 浙江大学农生学院 委员 1：何金龙 研究员 江苏省农业厅 委员 2：石春海 教授 浙江大学农生学院 委员 3：唐灿明 教授 南京农业大学农学院 委员 4：谢关林 教授 浙江大学农生学院 委员 5：王学德 教授 浙江大学农生学院 答辩日期： 2008-12-10 Optimization of Cotton Tranformation System and The Transformation of Resistant Gene to Verticillium Wilt Authors signat

3、ure: Supervisors signature: Thesis reviewers： Anonymity Chair： ZhANG Guoping Prof. College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University Committeeman 1: HE Jinlong Prof. JiangSu agriculture department Committeeman 2：SHI Chunhai Prof. College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang Univers

4、ity Committeeman 3：TANG Canming Prof. College of Agriculture Nanjing Agricultural university Committeeman 4：XIE Guanlin Prof. College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University Committeeman 5：WANG Xuede Prof. College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University Date of oral defen

5、ce： 2008-12-10 致致 谢谢 本论文是在导师王学德教授的悉心指导下完成的。从论文选题、试验设计到论文撰 写等各个环节都倾注了导师的大量心血。三年来，导师广博的专业知识、严谨的治学态 度、务实创新的科学精神、敏锐的洞察力、忘我的工作热情以及对科学执着的追求对我 产生了深刻的影响，并将使我受益终生。导师三年来的谆谆教诲和生活上的关心照顾， 使我能顺利的完成学业，值此论文完成之际，谨向导师表示诚挚衷心的感谢与崇高的敬 意！ 在学习和论文的实验过程中，得到了许多老师和同学的关心、鼓励和帮助。衷心感 谢浙江大学的祝水金教授、石春海教授、张宪银副教授、朱红波老师、潘刚老师、洪彩 霞老师、吴玉香

6、老师和孔广超老师等在学业上和工作上对我的关怀和指导。感谢同实验 室朱云国、张小全、蒋培东、朱伟、华水金、邵明彦、张昭伟、袁淑娜、解海岩、王晓 玲、倪密、刘英新、文国吉等在学习、实验、论文撰写和生活等过程中给予我关心、支 持和帮助。同时，感谢同学黄艳青、田爱梅、孟华兵、李源龙、朱慧琴、郑燕、杨龙、 童旭红、张小波等在我科研和生活上的大量帮助，论文的顺利完成得益于他们在科研、 生活和工作上给予的热情、细心的帮助和照顾，在此真诚的感谢他们！ 感谢山西省农业科学院农作物品种与资源研究所的领导和同事对我学习上、 生活上 的关心和帮助！ 感谢我的父母多年来在生活、学习和工作上对我的鼓励和支持！感谢父母多年

7、的养 育之恩和对我的无私支持！愿我学业的完成能使你们感到欣慰！ 感谢我的爱人郝作为先生在我学习和科研遇到挫折时，给我大力的鼓舞，感谢几年 来给我的精神鼓励和经济支持！ 最后，谨向参加本论文评阅和答辩的各位专家以最真挚的感谢！ 时光飞逝，三年学习生活匆匆而过，美丽的华家池、慈爱的导师、可爱的同学以及 温暖和睦的实验室集体都将成为我记忆中磨灭不掉的印痕，愿大家幸福永远！ ！ 张海平 2008 年 12 月于浙江大学 目录 I 目目 录录 目目 录录. I 摘摘 要要.VI AbstractIX 缩写词表（缩写词表（Abbreviations）. XIII 第一章第一章 文献综述文献综述.1 1.1

8、 棉花组织培养.1 1.1.1 植物组织培养概述1 1.1.2 棉花体细胞培养及影响因素2 1.1.2.1 棉花体细胞培养3 1.1.2.2 棉花体细胞培养的影响因素.5 1.1.2.3 棉花体细胞培养中存在的问题.9 1.2 棉花遗传转化的研究进展 10 1.2.1 棉花遗传转化研究的方法10 1.2.1.1 根癌农杆菌介导法.11 1.2.1.2 基因枪法.14 1.2.1.3 农杆菌法和基因枪法相结合.15 1.2.1.4 花粉管通道法.15 1.2.1.5 其他途径.16 1.2.2 棉花遗传转化的成就.16 1.2.2.1 抗虫基因的分离与转基因抗虫棉的获得16 1.2.2.2 抗除

9、草剂基因工程棉花17 1.2.2.3 抗逆及品质改良转基因棉花.18 1.2.2.4 转基因彩色棉.19 1.3 棉花抗黄萎病研究20 1.3.1 棉花黄萎病致病机理及其抗性遗传20 1.3.1.1 黄萎病致病机制20 1.3.1.2 棉花抗黄萎病的遗传方式21 1.3.2 棉花对黄萎病抗病机制的研究进展.22 1.3.2.1 棉花对黄萎病的形态抗性.22 1.3.2.2 棉花对黄萎病的生理生化抗性22 1.3.2.3 棉花对黄萎病的生态抗性.23 1.3.3 棉花抗黄萎病育种研究进展.24 1.3.3.1 利用抗病性种质资源的育种研究进展.24 1.3.3.2 棉花转基因抗黄萎病的研究进展.

10、25 1.3.4 目前存在的问题及解决办法.25 1.4 棉花纤维发育研究进展26 1.4.1 棉花纤维细胞的分化与发育.26 1.4.1.1 棉花纤维细胞的分化和突起.26 1.4.1.2 棉纤维的伸长.28 浙江大学博士学位论文 II 1.4.1.3 棉纤维次生壁的形成30 1.4.1.4 脱水成熟30 1.4.2 棉花胚珠离体培养体系的建立.30 1.4.2.1 棉花胚珠离体培养体系的建立.31 1.4.2.2 棉花胚珠离体培养在研究棉花纤维起始和发育研究中的应用.31 1.4.3 棉纤维特异启动子的研究进展.34 1.5 本研究的主要内容及意义 36 第二章第二章 棉花组织培养体系的优

11、化棉花组织培养体系的优化.38 2.1 材料与方法.39 2.1.1 材料.39 2.1.2 实验方法39 2.1.2.1 培养基的配制39 2.1.2.2 培养方法.40 2.1.2.3 几种金属离子对棉花体细胞培养的影响.40 2.1.2.4 试管苗的移栽41 2.2 结果与分析41 2.2.1 基本培养基及激素对诱导愈伤组织的影响.41 2.2.2 不同培养基对愈伤组织继代培养的影响.42 2.2.3 激素种类及配比对胚性愈伤组织的诱导和胚状体发生的影响 .43 2.2.5 几种金属离子在棉花组织培养中的作用44 2.2.5.1 四种金属离子在棉花愈伤组织诱导和分化中的作用44 2.2.

12、5.2 愈伤组织继代和分化过程中多种金属离子的协同作用.45 2.2.6 苗的直接移栽和嫁接移栽46 2.2.6.1 直接移栽46 2.2.6.2 嫁接移栽.46 2.2.7 陆地棉体细胞胚胎发生和植株再生.46 2.3 讨论.47 2.3.1 基本培养基对愈伤诱导的影响47 2.3.2 激素对棉花体细胞培养中胚性愈伤组织诱导的影响.48 2.3.3 几种金属离子对棉花体细胞培养的影响.48 2.3.4 棉花再生植株移栽的关键技术.49 第三章第三章 农杆菌介导的棉花基因转化体系的优化农杆菌介导的棉花基因转化体系的优化.50 3.1 材料与方法51 3.1.1 材料.51 3.1.2 棉花农杆

13、菌转化体系的优化.52 3.1.2.1 培养基及培养条件.52 3.1.2.2 转化方法52 3.1.3 农杆菌介导棉花下胚轴转化的因子优化.53 3.1.3.1 潮霉素有效浓度的筛选试验.53 3.1.3.2 羧苄青霉素和头孢霉素对下胚轴诱导愈伤组织的影响.53 3.1.3.3 菌种对基因转化的影响53 3.1.3.4 农杆菌菌液浓度对基因转化的影响53 3.1.3.5 浸染时间对基因转化的影响53 目录 III 3.1.3.6 乙酰丁香酮的浓度对基因转化的影响.54 3.1.3.7 共培养温度对基因转化的影响.54 3.1.3.8 共培养时间对基因转化影响54 3.1.4 抗性愈伤组织的

14、GUS 检测.54 3.1.5 PCR 检测.54 3.2 结果与分析55 3.2.1 下胚轴和愈伤组织对潮霉素的敏感性55 3.2.2 羧苄青霉素和头孢霉素对出愈率的影响.55 3.2.3 农杆菌菌种对基因转化的影响.56 3.2.4 农杆菌菌液浓度对基因转化的影响.57 3.2.5 农杆菌浸染下胚轴的时间对基因转化的影响57 3.2.6 乙酰丁香酮（AS）对转化率的影响.57 3.2.7 共培养温度对基因转化的影响58 3.2.8 共培养时间对基因转化的影响58 3.2.9 农杆菌介导棉花下胚轴基因转化的程序.60 3.2.10 抗性愈伤组织（转化体）的鉴定60 3.2.10.1 抗性愈伤

15、组织的 GUS 染色.60 3.2.10.2 抗性愈伤组织的 PCR 检测 .61 3.3 讨论61 3.3.1 基因转化中的抗生素选择61 3.3.2 农杆菌菌种和菌液浓度对基因转化的影响.62 3.3.3 共培养对基因转化的影响.62 3.3.4 乙酰丁香酮对基因转化的影响.63 第四章第四章 转抗菌肽基因棉花的获得转抗菌肽基因棉花的获得.64 4.1 材料与方法65 4.1.1 材料.65 4.1.2 方法.65 4.1.2.1 苜蓿种子总 RNA 的提取 65 4.1.2.2 cDNA 第一链的合成 66 4.1.2.3 PCR 扩增目的基因 .67 4.1.2.4 目的基因的克隆和测序67 4.1.2.5 目的片段与双元载体连接和转化.69 4.1.2.6 感受态农杆菌的制备.70 4.1.2.7 冻融法转化农杆菌.70 4.1.2.8 棉花的遗传转化.70 4.1.2.9 转化体的潮霉素抗性检测.70 4.1.2.10 转基因植株的分子检测.70 4.2 结果与分析74 4.2.1 双元载体 pCAMBIA1301-alfAFP 的构建.74 4.2.1.1 RNA 的提取和反转录 74 4.2.1.2 alfAFP 基因的扩增及测序 .74 4.2.1.3 alfAFP 基因与双元载体连接 .75 4.2.2