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1、实验一 细胞培养的基本技术一、实验目的1、了解细胞培养室的设置、设备和基本要求。2、掌握细胞培养用器械的清洗、消毒方法及无菌操作技术。二、实验材料1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。2、实验器材：不同规格毛刷、烧杯、量筒、搅拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。三、实验步骤（一）器械的清洗1、玻璃器皿的清洗（植物细胞培养只需、操作即可）：清水浸泡：浸泡主要是软化器皿表面所附着的物质。刷洗：将浸泡后的玻璃器皿在洗涤剂中用毛刷反复刷洗，以除去器皿表面的杂质。烘干备用。浸酸：将经过刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸配置而成的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能
2、残留的有机物。浸泡时间要在6小时以上，最好过夜（用于动物细胞培养）。冲洗：浸酸后的器皿从洗液中取出后，用自来水冲洗10遍以上。再用蒸馏水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱内（4050）烘干（用于动物细胞培养）。2、金属器械的清洗和消毒：金属器械不能在清洁液中浸泡，一般用洗涤剂洗刷干净后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净，烘干。3、胶塞的清洗和消毒：细胞培养中使用的胶塞不能用清洁液浸泡。清洗过程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分钟。自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟，最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。注意使用后的胶塞应及时浸泡在清水中。4、塑料物品
3、的清洗：塑料物品用后立即用流水冲净或浸入清水中，防止干涸。一般不用刷洗以防划痕和损伤。清洗干净的器皿先在2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟。最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。注：清洁液的配制（盛装于瓷缸中，用于动物细胞培养时玻璃器皿的清洁）成分强酸溶液次强酸溶液弱酸溶液重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）6310002001202002001001001000（二）器械的消毒灭菌造成细胞培养失败的主要原因是发生污染，特别是微生物的污染，因此对细胞培养中所用的器械进行消毒灭菌是非常重要的。最常用的物理消毒方法有如下几种：1、紫外线消
4、毒：紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。目前，多用紫外灯直接照射培养室内空气、地面、工作台表面等进行消毒。2、高温干热灭菌：一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热灭菌后的器皿干燥，易于存放。但是，干热传导慢，可有冷空气存留于烤箱内，需要较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，因此需加温到160，保持90-120分钟。消毒后不可马上将烘箱门打开，以免冷空气进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外。3、压力蒸汽灭菌：一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。为保证消毒的效果，待消毒的物品不应装得太满，以便消毒器内空气流通。在加热升压之前，打开排气阀门，以使加热后消毒器内的冷空气排出。冷空
5、气排完后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需压力后，开始计时，一般为100KPa、121下灭菌1520分钟。消毒完毕后，不要立刻打开盖子，应先等压力自行下降到一定程度后，打开排气阀，放气后，再打开消毒器的盖，将物品取出，放入烤箱内烘干。4、过滤除菌：是将液体或气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的目的。目前，多数实验室采用微孔滤膜滤器除菌，滤膜孔径为0.220.45m。（三）培养材料的消毒灭菌采自自然界的实验材料，携带微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。采来的实验材料先用流水冲洗1020min或更长时间，然后在一定浓
6、度药剂中浸泡处理（须在超净工作台上操作），进行表面消毒灭菌。所用的药剂种类、浓度、处理时间随植物种类和取用的器官部位的不同而异，常用消毒剂的灭菌效果见表1-1。消毒剂对植物组织是有毒的，应正确选择其浓度和处理时间，减少它对组织的伤害。经过灭菌的材料，需用无菌水清洗45次，沥去水分待用。表1-1 常用消毒剂消毒灭菌效果比较表消毒剂使用浓度（%）去除的难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和浓度1210120.11707545（mg/L）1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较
7、好好（四）无菌操作室的消毒灭菌无菌材料进行接种或传代时，必须从各方面防止任何污染物进入容器，所以接种区的消毒至关重要。由于接种区的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒灭菌（常用每立方米含2ml甲醛和1g高锰酸钾的消毒液或6ml/m3乙二醇等加热熏蒸）。每次接种前都应进行地面卫生清洁，并用紫外灯照射20min，进行空气的消毒灭菌。对接种用的超净工作台，每次接种前用紫外灯照射20min，同时用7075%酒精擦洗，然后方可进行培养材料的接种。（五）无菌操作培养材料接种时的无菌操作过程除上述各项消毒灭菌操作外，还需完成以下无菌操作步骤，从而获得接种的无菌培养材料
8、。1、无菌操作前的准备工作：工作人员无菌操作前需穿好工作服、戴上工作帽和口罩，坐在超净工作台前，将各种操作所用金属器械浸泡在盛有95%（或70%）酒精溶液的广口瓶中，点燃洒精灯，在耐热器皿（如不锈钢小盘或搪瓷盘）中加入少量酒精，将蘸有酒精的金属器械及器械支架放入耐热器皿中灼烧，待冷凉后将器械置器械支架上备用，所有操作器械每次使用后都要灭菌；用70%75%的酒精擦拭新培养容器和继代培养容器表面，放置超净工作台上待用；再用同样浓度的酒精擦拭双手和前臂，完成无菌操作准备工作。2、无菌操作步骤：准备工作完成后，对来自于自然生长条件下的外植体，按前述培养材料的消毒灭菌方法灭菌后取出，放入已消毒灭菌的培养
9、皿中，然后置于超净工作台酒精灯火焰下方，用灭菌剪刀等器械进行适当分离、切割或其它处理后备用。在酒精灯火焰处将培养容器的瓶塞（盖）轻轻打开，瓶口在火焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，将镊子放在酒精瓶中蘸酒精，置于酒精灯火焰上灼烧后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞（盖）数妙后塞回瓶口。对继代培养材料的无菌操作，需在灯焰处打开瓶塞（盖），继代培养材料为液体培养细胞时直接用灭菌吸管吸取培养细胞液放入新鲜培养基中；继代材料为固体培养细胞时，用灭菌镊子挑取适量材料置新鲜培养基上；继代材料为其它组织时，用灭菌剪刀或其它器械对培养材料进行适当切割后，用灭菌镊子将其置于新鲜培养基上（中），然后迅速灼燎瓶塞（
10、盖）数妙后塞回瓶口。3、污染源及其表现特征当培养材料、转接器皿、无菌操作环境等消毒灭菌不彻底时，培养材料则携带有微生物，当其被转接到营养丰富的培养基上时，微生物繁殖迅速，出现各种污染菌斑。微生物生长时分泌出对植物组织有毒的代谢废物，致使培养材料死亡或失去使用价值。在培养过程中，若培养材料附近出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫，则是细菌性污染。在细菌性污染中，特别要注意一种呈乳白色的芽孢杆菌，它们出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内，若出现应严格灭菌。而培养基表面出现的黄色、白色、黑色等不同颜色的霉菌，属真菌性污染。此外，需提及与微生物污染无关的酚类物质污染，因它也是培养材料常遇到的
11、问题，它是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞中的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生醌类，这类物质呈棕褐色，使培养材料褐变，甚至接种后使培养基变褐，严重影响培养物的生长发育。可以利用一些抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸等进行材料的预处理或预培养，或者在培养基中加入抗氧化剂或吸收酚类物质的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、活性碳等来减轻醌类物质的毒害。实验二 动物细胞培养基的配制一、实验目的1、掌握含血清细胞培养液的配制方法。2、掌握胰蛋白酶溶液的配制方法。二、实验材料1、实验设备：电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。2、实验器材：烧杯、量筒、
12、搅拌棒、血清瓶（分装培养液用）、0.22m滤膜。三、细胞培养液DMEM的配制动物细胞培养使用的培养液一般由合成培养基和新生牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，即商品培养基或称干粉培养基。根据不同的细胞种类，可以选择不同的合成培养基。其中最常见最常使用的商品培养基为DMEM和RPMI-1640干粉培养基。本实验仅以DMEM为例，介绍其配制方法。1、按包装袋上的说明，将一袋DMEM粉剂用新鲜三（次）蒸馏水溶解。2、按包装袋上的说明，将一定量的NaHCO3加入DMEM溶液中。3、加入抗生素，使青霉素钠的终浓度达到100g/ml，（硫酸）链霉素的终浓度达到100U/ml。4、调培养液pH至7.07.
13、2（此时培养液为鲜红色，也称樱桃红色）。5、超净台内过滤除菌。6、加入经灭活处理的新生牛血清，其中浓度为10%20%（根据实际情况，血清可在细胞培养操作时加入）。7、分装，-20贮存备用（不加灭活血清的培养基可于4保存1个月）。四、胰蛋白酶溶液的配制1、D-Hanks溶液的配制：准确称取NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO412H2O 0.716g、KH2PO4 0.06g、NaHCO3 0.35 g，溶解于三（次）蒸馏水中，调pH至7.07.2，定容为1000ml。高压灭菌后，于超净台内加入过滤除菌的青霉素、（硫酸）链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100g/ml。4冰箱
14、保存待用。2、胰蛋白酶消化液的配制：用D-Hanks溶液将胰蛋白酶配成浓度为0.25%的工作液，过滤除菌后，-20贮存备用。实验三 动物细胞的传代培养及冻存一、实验目的1、 掌握细胞传代培养的原理及操作方法。2、掌握细胞冻存的方法。二、实验原理 传代培养是组织培养的常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖。对于贴壁生长的细胞，单层细胞互相汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。对于悬浮生长的细胞，细胞相互汇集成团。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足，营养障碍而死亡。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中的过程称为传代（或称继代）。传代可
15、获得大量细胞供实验所需。 体外培养的细胞，随着传代次数的增加，其各种生物特性会渐渐发生变化。为此，需将培养的细胞及时冻存。直接冻存细胞会导致细胞内外环境形成冰晶，从而使细胞内部发生一系列变化，进而引起细胞死亡。因此，冻存细胞时常向培养液中加入适量的甘油或DMSO(二甲基亚砜)，从而使冰点下降，通过缓慢冻存，避免或减少冰晶的形成。三、实验材料1、实验设备：超净工作台、倒置相差显微镜、pH计、CO2培养箱、台式离心机、恒温摇床等。2、实验器材：吸量管、培养皿、离心管、冻存管、细胞记数板、细胞计数器、微量移液器等。3、实验试剂：D-Hanks溶液、含10%新生牛血清的DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶溶液、细胞冻存液。四、实验步骤（一）细胞传代1、贴壁生长的细胞（1）取80%汇合或刚汇合形成单层的细胞，吸弃旧培养液，用平衡盐溶液洗去残留的培养液。（2）加入少量的胰蛋白酶液，37放置3-5分钟，倒置相差显微镜下观
