志贺菌多重耐药的分子机制研究

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1、郑州大学 博士学位论文 志贺菌多重耐药的分子机制研究 姓名：宋春花 申请学位级别：博士 专业：流行病与卫生统计学 指导教师：段广才 20070530 郑州大学2 0 0 7 屑博士学位论文志贺菌多重耐药的分子机制研究 志贺菌多重耐药的分子机制研究 博士研究生 导师 宋春花 段广才教授 郑州大学公共卫生学院郑州4 5 0 0 0 1 中文摘要 志贺菌属( S h i g e l t as p p ) 引起的细菌性痢疾发病率居我国传染病发病率的 前三位。近年来随着抗生素的广泛使用、甚至滥用，使志贺菌频繁出现耐药株， 且耐药率高、耐药产生速度快、范围广、多重耐药，1 9 9 6 年W H O 认定志

2、贺菌 为给人类带来巨大威胁的耐药性菌株。国内外资料显示志贺茵属多重耐药现象严 重，因此深入系统地了解志贺菌多重耐药机制及如何解决多重耐药性问题己成为 目前细菌性痢疾的主要研究热点。 细菌对不同结构类别或不同作用机制的抗菌药物都能产生耐药性，即多重耐 药( m u l t i d r u gr e s i s t a n t ) 。目前对志贺菌多重耐药机制的研究表明：志贺菌对氨 基糖苷类抗生素的耐药主要是通过表达A A C ( 3 ) 1 1 酶；对1 3 内酰胺类抗生素的耐 药主要是表达B 内酰胺酶破坏抗生素结构：志贺菌对喹喏酮类抗生素的耐药机 制主要源于靶基因D N A 旋转酶( g y r

3、 A ，g y r B ) 和拓扑异构酶( p a r C ，p a r E ) 发 生突变；另外，志贺菌M r 4 3 ，0 0 0 外膜蛋白表达减少，m a r A 基因存在点突变导致 膜耐药：有研究表明a c r A 基因介导的主动流出机制在临床多重耐药志贺菌中存 在：在志贺菌整合子耐药机制方面，I I 型整合子起主要作用。以上这些耐药机制 不是相互孤立存在的，它们所产生的协同作用使志贺菌产生了对多种抗菌药的高 度耐药性即高水平的多重耐药性。 细菌获得耐药性主要通过药物自身诱导的垂直方式及基因水平转移方式两 种途径获得。无论何种方式导致的细菌多重耐药都是多基因、多蛋白参与的一个 复杂过程

4、，而当前的研究多局限于某一机制的个别基因及蛋白，不但难以解释细 菌多重耐药的全部现象，更不能全面揭示细菌多重耐药的分子基础及机制。目前 郑州人学2 0 0 7 届博十学位论文志贺菌多重耐药的分子机制研究 尚缺乏志贺菌从敏感株转变为多重耐药株的系统的、全面的研究和评价资料，而 本课题的设计立足于整体，从全基因组、蛋白质组的角度研究志贺菌的耐药机制。 本课题以对多种抗生素敏感的志贺菌株为研究对象，采用抗生素次抑菌浓度 自身诱导及接合基因转移两种方式，分别构建多重耐药菌株，通过抑制性消减杂 交技术阐明志贺菌多重耐药的核酸基础：通过对志贺菌多重耐药蛋白质组学研 究，从蛋白质水平上阐明志贺菌多重耐药相关

5、蛋白的种类及其作用：并综合评价 志贺菌在多重耐药产生过程中获得耐药性的主要方式及其共存的耐药机制，为志 贺菌的分子流行病学监测、研发新型抗菌药物及指导临床j 下确使用抗生素提供科 学依据。 实验方法 1 最低抑菌浓度的测定 以头孢噻吩( c e f a l o t i n ，C F ) 、诺氟沙星( n o r f l o x a c i n ，N O R ) 、庆大霉素 ( g e n t a m y c i n ，G M ) 、磺胺甲基异恶唑( c o t r i m o x a z o l e ，S M Z ) 四种抗生素为指示 药物，采用改良K i r b y B a u e r 法筛

6、选临床分离的福氏志贺菌敏感株和大肠埃希菌 多重耐药株，用琼脂稀释法测定抗菌药物对志贺菌敏感株的最低抑菌浓度 ( m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，M I C ) 。 2 次抑菌浓度诱导实验 志贺菌敏感株在1 1 2M I C 的抗生素L B 培养基中连续1 2 代培养，若诱导后 M I C 二一 4 倍诱导前即为诱导多重耐药菌株( 以下简称诱导株) 。 3 接合转移实验 以筛选出的志贺菌敏感株为受体菌，以多重耐药大肠埃希菌为供体菌，在约 4 倍M I C 抗生素浓度作用下进行接合转移构建志贺菌基因转移多重耐药株

7、( 以 下简称转移株) 。 4 志贺菌多重耐药抑制性消减杂交文库的构建 采用抑制性消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，S S H ) 实验 ( 1 ) 采用细菌基因组提取试剂盒提取志贺菌敏感株、诱导株及转移株的全基 因组D N A ，以志贺菌敏感株基因组D N A 为参照( D r i v e r ) ，诱导株、转移株基因 组D N A 为样本( T e s t e r ) ，T e s t e r 和D r i v e r 的D N A 分别用同种识别四碱基序 郑州人学2 0 0

8、 7 届博十学位论文志贺苗多重耐药的分子机制研究 列的限制性内切酶R s a1 四碱基酶切获得平均长度约6 0 0 b p D N A 片段。 ( 2 ) 将T e s t e rD N A 均分为两份，分别接上接头A d a p t o r1 和A d a p t o r2 R 。接 头外侧序列与第1 次P C R 引物序列相同，而内侧序列则与第2 次巢式P C R 引物 序列相同，有利于后续P C R 的筛选扩增。此外接头上含有T 7 启动子序列及内切 酶识别位点，为以后克隆和测序提供方便。2 琼脂糖凝胶电泳鉴定连接效率在 2 5 以上，说明D N A 片段与接头连接效率较高。 ( 3 )

9、 两轮消减杂交：用过量D r i v e rD N A 样品分别与上述两份连有接头的 T e s t e rD N A 样品进行第1 次消减杂交。然后，混合上述两份杂交样品，同时加 入新的变性D r i v e rD N A 进行第2 次消减杂交，这一次杂交进一步富集了差异 D N A 。 ( 4 ) 两次P C R 反应：加入根据接头设计的引物进行两次P C R ；第一次P C R 基于抑制反应，只有两端连接有2 个不同接头的双链D N A 片段才能得到指数扩 增。第二次P C R 实际上是巢式P C R ，极大地提高了扩增特异性，使目的基因片 段得到大量富集。 ( 5 ) 消减效率的检测：

10、以经消减杂交和未经消减杂交第2 轮P C R 产物为模板， 2 3 Sr R N A5 和3 p r i m e r s 为引物进行P C R 扩增，评价消减效率。2 琼脂糖凝胶 电泳鉴定两次P C R 产物及消减效率。 ( 6 ) 将诱导及基因转移多重耐药抑制性消减杂交产物与p M D l 8 - T 载体连接 并转化D H 5a 高效感受态细胞，克隆增殖，蓝白斑筛选阳性克隆，并对全部阳 性克隆3 0 甘油保存，构建抑制性消减杂交文库。 5 志贺菌多重耐药相关基因的筛选 采用P C R 技术分别对两个消减杂交文库中部分阳性克隆鉴定后利用斑点 杂交对鉴定的阳性克隆P C R 产物进行筛选。对筛

11、选到的多重耐药相关基因用 M 1 3 双向引物测序，并将测序结果在B L A S T 上进行同源性比对。 6 志贺菌多重耐药的蛋白质组学分析 ( 1 ) 应用双向电泳( t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - D E ) 技术比较志贺菌多 重耐药株与敏感株的全菌蛋白表达谱。采用超声兼U r e a C H A P S D T T 裂解提取 法制备志贺菌敏感株、诱导株、转移株全菌蛋白，B r a d f o r d 法蛋白定量。 ( 2 ) 将提取的三种菌株的1 0 0 p g 全菌蛋白在I P G p h o

12、r 水平电泳仪上进行第一 郑州大学2 0 0 7 届博十学位论文：占贺苗多重耐鲥的分子机制研究 相等电聚焦，然后在含有D T T 和碘乙酰胺的平衡液中分别平衡1 5 m i r a 转移到 第- k l lS D S P A G E 凝胶，在恒功率( 1 8 W g e l ) 条件下进行分离。分析型凝胶采 用银染染色，制备型凝胶采用考马斯亮兰染色。 ( 3 ) 用A m e r s h a mB i o s c i e n c e 的扫描仪投射扫描，分辨率为3 0 0 d p i 。数字化 图像文件运用I m a g eM a s t e r2 DP l a t i n u m 软件分析。

13、( 4 ) 全部差异蛋白质点切下一8 0 。C 保存，挑取部分差异蛋白点做M O L D I T O F 质谱鉴定，利用M a s c o t ( h t t p ：p r o s p e c t o L u c s f e d u ) 和P r o f o u n d ( h t t p ：1 2 98 5 1 9 1 9 2 p r o f o u n db i n W e b P r o F o u n d e x e ) 软件，在N C B I m 蛋白数据库中检索。 结果 1 诱导及转移株的获得 琼脂稀释法测定四种药物对志贺菌敏感株的M I C 分别为C F3 2 mg L 、 N

14、O RO 5m g L 、G M2 m g L 、S M Z5 1 2 m g L 。 ( 1 ) 次抑菌浓度( I 2 M I C ) 诱导多重耐药结果：志贺菌诱导后的多重耐药菌 株，分别是出发菌株的6 倍( C F ) 、6 倍( N O R ) 、8 倍( G M ) 、8 倍f S M Z ) M I C 。 ( 2 ) 接合转移多重耐药结果：志贺菌敏感株经与多重耐药大肠杆菌接合转 移实验后基因转移多重耐药志贺菌的M I C 分别是头孢噻吩2 5 6m g L 、诺氟沙 星4 0m g r c 、庆大霉素2 0m g L 、磺胺甲基异恶唑5 1 2 0m g L 。将基因转移后多 重耐

15、药的志贺菌作药敏试验，结果4 种药物均无抑菌环出现。 2 志贺菌多重耐药抑制性消减杂交文库的构建 ( 1 ) 连接效率检测可见由引物2 3 Sr R N A F o r w a r dP r i m e r 与接头l ，2 外侧序 列引物P C RP r i m e r l 扩增所得条带的亮度和由引物2 3 Sr R N A F o r w a r d 与R e v e r s e P r i m e r 扩增所得条带的亮度相差小于2 倍，表明连接效率大于5 0 。 ( 2 ) 经两轮消减杂交、两轮抑制性P C R 后，差异片段大量富集，诱导及基 因转移多重耐药消减杂交产物扩增的D N A 条

16、带成弥散状分布，大小从1 0 0 2 0 0 0 b p ，与预期结果相符。 ( 3 ) 本次实验消减效率分析表明，消减后的转移株及诱导株D N A 均在2 8 个循环之后才看到2 3 Sr R N A 扩增产物，而未消减的转移株及诱导株D N A 可在 郑州大学2 0 0 7 届博士学位论文志贺菌多重耐药的分子机制研究 1 8 个循环就看到2 3 Sr R N A 产物，说明两份样品的消减效率均较高。 ( 4 ) 志贺菌敏感株与诱导株抑制性消减杂交基因片段经与p M D l 8 一T 载体 连接、转化克隆后，共获得1 5 1 2 个阳性克隆，随机挑取了2 1 6 个阳性克隆做菌 液P C R 鉴定，有2 0 2 个克隆含有插入片段，转化率为9 3 5 2 ；同样敏感株与转 移株共获得1 0 8 0 个阳性克隆，随机挑取了1 9 2 个阳性克隆做菌液P C R 鉴定，有 1 8 1 个克隆含有插入片段，转化率9 4 2 7 ，且所有片段长度均在2 0 0 0 b p 以下，