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1、1 分子生物学常用技术分子生物学常用技术 与研究进展学习班与研究进展学习班 2012 年年 11 月月 27 日日11 月月 30 日日 实习书实习书 日期 内容 27 日 聚合酶链反应（PCR） 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶中目的 DNA 片段的回收 体外 DNA 连接 28 日 组织总 RNA 的提取 重组质粒的转化和筛选 逆转录 PCR 29 日 荧光定量 PCR 挑菌培养 30 日 小量提取质粒 DNA 质粒 DNA 酶切反应 Group 5 Name 薛薛 刚刚 李银生李银生 2 11 月月 27 日日 实验一：实验一：聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR） 【试剂试剂】 1、2Taq
2、PCR MasterMix 2、Primer：Pup、Pdown 【实验步骤实验步骤】 1、在 0.2ml PCR 管中依次加入下列物质，并混匀。 试剂试剂 体积（体积（l） 2Taq PCR MasterMix 12.5 Pup 1 Pdown 1 DNA 1 ddH2O 9.5 2、将上述 PCR 反应混合物混匀放入 PCR 扩增仪中。 95 5min 1 个循环 95 30sec 35 个循环 60 30sec 72 30sec 72 10min 1 个循环 4 hold 3、取 525l PCR 产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳。 【实验实验结果结果】 3 实验二：实验二：琼脂糖凝胶电泳琼
3、脂糖凝胶电泳 【试剂试剂】 1、琼脂糖 2、10mg/ml EB 3、TAE（50）： Tris 242g CH3COOH 57.1ml 0.5M EDTA（pH8.0） 100ml ddH2O to 1000ml 【实验步骤】【实验步骤】 1、称 0.75g 琼脂糖，加 50ml 电泳缓冲液（1TAE）加热熔化。 2、 胶液冷却至 60时， 加入 2l EB， 小心混匀， 缓慢倒入制胶模具中， 在胶一端插上梳子。 3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入 1TAE，让液面高于胶面至少 1mm。 4、上样。 5、接通电泳仪电源，1-5V/cm 电压（一般 80100V），开始电泳
4、。 6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进 行观察或拍照。 【实验实验结果结果】 4 实验三：实验三：琼脂糖凝胶中目的琼脂糖凝胶中目的 DNA 片段的回收片段的回收 【试剂试剂】 博迈德凝胶回收纯化试剂盒 【实验步骤实验步骤】 1、 在长波紫外灯下， 用干净刀片将所需回收的 DNA 条带切下， 尽量切除不含 DNA 的凝胶， 得到凝胶体积越小越好。 2、将切下的含有 DNA 条带凝胶放入 1.5ml 离心管（原则上应称重），加入 3 倍体积溶胶液 DD（大约 400l）。 3、56水浴放置 10min（或直至胶完全溶解）。每 23min 颠倒混匀一次加
5、速溶解。 4、将上一步所得溶液加入吸附柱 EC 中 （吸附柱放入收集管中） ，室温放置 1min， 12000rpm 离心 60sec，倒掉收集管中的废液。 5、加入 500l 漂洗液 WB，12000rpm 离心 30sec，弃掉废液。 6、加入 500l 漂洗液 WB，12000rpm 离心 30sec，弃掉废液。 7、将吸附柱 EC 放回收集管中，12000rpm 离心 2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留 乙醇抑制下游反应。 8、室温放置 5min。 9、取出吸附柱 EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入 30l 超纯水（超 纯水事先在 6570水浴中加热效果更好）
6、，室温放置 2min，12000rpm 离心 1min。 10、使用紫外分光光度计检测 DNA 的浓度，同时进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 【实验实验结果结果】 样本样本 浓度浓度(ng/L) OD260/280 OD260/230 OD260 OD280 OD230 OD320 5-1 9.71 2.32 0.06 0.186 0.076 3.461 -0.008 5-2 18.5 2.15 0.30 0.355 0.157 1.206 -0.015 5 实验实验四四：体外体外 DNA 连接连接 【试剂试剂】 pGM-T 克隆试剂盒 【实验步骤实验步骤】 1、将载体在冰上融化（尽可能避免
7、反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使 用时取出一份），瞬时离心装有载体的 EP 管，以免液体挂在管壁上。 2、根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度，确定需要加入的目的基因片段比例。在 EP 管中配制连接反应体系，瞬时离心，4过夜。 试剂试剂 体积体积(l) 10T4 DNA Ligation Buffer 1 .0 纯化后目的基因 X pGEM-T 载体（约 50ng/l） 1.0 T4 DNA Ligase（3U/l） 1.0 ddH2O to 10 6 11 月月 28 日日 实验五：实验五：组织组织 RNA 的提取的提取 【试剂试剂】 Trizol、无核酶水、氯仿、2-丙
8、醇、75%乙醇 【实验操作】【实验操作】 1、准备工作： 操作人员：戴口罩、手套 工作区域：实验室事先经紫外线照射过夜，实验开始前用75%乙醇擦拭台面。实验过程中不 要随意接触非实验物品并尽量减少走动。 实验器具：用75%乙醇擦拭移液器和 EP管架；低温离心机预冷至4；准备-20预冷的75% 乙醇。 2、总RNA的提取 1）从小鼠体内取出肝脏、全脑组织，用预冷的生理盐水清洗。 2）使用液氮迅速冷冻组织，-80冰箱保存。 3）液氮充分预冷研钵。 4）迅速把已称重的冷冻组织（约0.05g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，期间 不断加入液氮，直至组织被研磨成粉末状（无明显的可见颗粒）。 5）
9、向每0.05g研磨成粉末状的样品中加入1ml Trizol，并完全覆盖样品。 6）室温静置30min。 7）待样品完全融化后，用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转移至1个1.5ml EP管 中，室温静置5min，4 12000rpm离心5min后，把上清转移至新的1.5ml EP管中。 8）每毫升Trizol中加入氯仿0.2ml，盖紧EP管盖，用手剧烈振荡混匀，直至溶液呈乳白色，无 分相现象。 9）室温静置5min。4 12000rpm离心15min。离心过程中，准备新的1.5ml EP管。 10）从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，上层是透明的水层，RNA溶解在此层 中；半固
10、体状的中间层，此层中包含DNA；下层为粉红色的有机溶剂，蛋白质、多糖等物质 溶解在此层中。 11）把上层溶液小心转移至新的EP管中，大约每个EP管中能取出500l，谨慎操作，切勿吸 到中间层。 12）往水相中加入等体积2-丙醇，上下颠倒EP管，充分混匀。 13）室温静置10min后，4 12000rpm离心15min。 14）小心弃去上清，白色沉淀即为总RNA。向含有沉淀的EP管中加入1ml、-20预冷的75% 乙醇，轻轻上下颠倒，洗涤沉淀。 7 15）4 12000rpm离心5min。 16）用移液器除去上清。 17）将EP管再次瞬时离心，用移液器将残存在EP管底部的少量液体除去。 18）打
11、开EP管盖，室温放置5min干燥 19）用RNase-free水溶解沉淀：肝脏组织用100l RNase-free水溶解；脑组织用25l RNase-free 水溶解。 20）RNA溶液保存在-80冰箱中。 3、RNA质量检测 1）吸光度测定方法 简介：核酸在260nm附近有强吸收，蛋白在280nm附近有强吸收，因此常利用此性质， 使用紫外分光光度计测定核酸溶液在260nm和280nm下的吸光度，根据A260的吸光度，计算 提取的核酸收量，根据A260/A280的比值来评价提取的核酸纯度。理想的RNA纯度A260/A280 应在1.82.2范围内。 实验操作：按照1:50的比例，用RNase-
12、free水稀释RNA样品；利用分光光度计测定260、 280及320nm波长下的光密度，计算其A260/A280的比值和RNA的浓度。 2）凝胶电泳方法 简介：利用1%的琼脂糖凝胶（含溴乙锭）电泳结果，对提取的Total RNA进行RNA完整性 以及是否有基因组DNA污染的评价。如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：28S和 18S；原核生物：23S和16S），且其浓度比值大约为2:1，则RNA未降解。若观察到smear，则 RNA已发生降解。如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组DNA污染，这时可 以考虑使用DNase处理。 【实验实验结果结果】 吸光度测定结果： 样
13、本样本 浓度浓度(ng/ L) OD260/280 OD260/230 OD260 OD280 OD230 OD320 5-1 779.5 2.02 0.98 0.522 0.324 0.528 0.132 5-2 658.5 1.96 1.00 0.521 0.360 0.521 0.192 凝胶电泳检测结果： 8 实验六：实验六：重组质粒的转化重组质粒的转化和筛选和筛选 【试剂试剂】 1、 LB/Amp/X-Gal/IPTG 平板 （含终浓度为 100g/ml Ampicillin， 20g/ml X-Gal、 24g/ml IPTG） 2、E. coli Competent Cells
14、DH5 【实验步骤实验步骤】 1、冰中解冻 E. coli Competent Cells DH5，融解后轻柔地混匀菌液。 2、 加入10l用于转化的DNA （10ng以下） 至50l Competent Cells中， 混匀后冰中放置30min。 3、42水浴 90sec，迅速移入冰中放置 23min。 4、加入预先 37保温的 500l LB 培养基，37振荡培养 45min（150 rpm）。 5、 4000rpm/min 离心 1min， 倒掉大部分上清， 保留约 100l 转化混合物涂 LB/Amp/X-Gal/IPTG 平板，37先正置培养 30min，后倒置培养过夜。 6、 挑取
15、阳性克隆 （含重组质粒的白色菌落） 接种于 3ml LB 液体培养基 （含 100g/ml Ampicillin） 中 220rpm 摇菌过夜。 9 试验七试验七：逆转录逆转录 PCR（RT-PCR） 【试剂试剂】 PrimeScript RT Reagent 【实验步骤实验步骤】 1、将实验六提取的总RNA溶液稀释至100ng/l。 2、配制逆转录反应混合液（要求冰上操作），反应体系如下： 试剂试剂 1 2 RNase Free ddH2O 1.5l 3.0l 5Primer Script Buffer 2.0l 4.0l Oligo dT Primer（50M） 0.5l 1.0l Ran
16、dom 6 mers（100M） 0.5l 1.0l PrimerScript RT Enzyme Mix 0.5l 1.0l Total RNA（100ng/l） 5.0l 10.0l 注：10l逆转录体系中加入500ng的Total RNA 3、逆转录反应在PCR仪中进行，反应条件如下： 37 15min（逆转录反应） 85 5sec（加热使逆转录酶失活） 4 Hold 4、反应结束后，将 cDNA 溶液放置于 4保存（长期保存需置于-20）。准备进行实时定 量 PCR 试验。结果见实验八。 10 11 月月 29 日日 实验实验八八：荧光定量：荧光定量 PCR 【试剂试剂】 1、UltraSYBR Mixture（2） 2、Primer：Pup、Pdown
