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1、上海交通大学 硕士学位论文 儿童急性B系淋巴细胞性白血病有效抗原组合及其临床意义研究 姓名：刘茵 申请学位级别：硕士 专业：儿科学（血液/肿瘤） 指导教师：汤静燕 20090401 儿童白血病抗原表达异常与基因突变研究 摘 要 第一部分 儿童急性B系淋巴细胞性白血病有效抗原组合及其临床意义研究 目的 目的 探讨使用流式细胞术FCM检测儿童急性 B 淋巴细胞白血病( B acute lymphoblastic leukemiaB-ALL)微小残留病Minimal Residual Disease, MRD时各个有效抗原组合的发生频率及各组合 分别与临床预后相关因素的关系 方法 方法 自 2002
2、 年 1 月 1 日起我院开始使用流式细胞术FCM检测儿 童急性 B 淋巴细胞白血病( B acute lymphoblastic leukemia B-ALL) 微小残留病Minimal Residual Disease, MRD本研究回顾性的分 析 2002 年 1 月 1 日起至 2008 年 5 月 31 日期间对 327 例我院初诊 的 B-ALL 患儿骨髓标本进行 MRD 筛选 其中 289 例有适合 MRD 检测的 抗原组合作为有效标记的患儿骨髓标本进行每组 4 个抗原共 9 组抗原组合检测 统计各有效抗原组合的发生频率并与国外报告进行 比较分析各抗原组合在临床预后因素分组中的分
3、布差异 结果 结果 1327 例初发 B-ALL 患儿中289 例存在至少 1 组可检测的有 效抗原组合其覆盖率为 88.42不同有效抗原组合的发生频 率不同以 TdT/CD10/CD34/CD19 组合频率最高为 70.59%中国患 儿有效抗原组合与国外报道有差异3部分有效抗体组合与临床 表型以及治疗反应相关CD38/CD10/CD34/CD19 在复发组病例中高表 达(P=0.045) CD66c/CD10/CD34/CD19 在BCR/ABL 阳性组 P=0.037 和复发组(P=0.047)中高表达 TdT/CD10/CD34/CD19 则更高表达于 MLL-AF4 阴性组 (P=0.
4、005)和强的松良好效应组(P= 0.002) CD58/CD10/CD34/CD19 与低复发率显著相关 (P=0.032). 结论 结论 1所选 9 组抗原组合在中国 B-ALL 儿童中的覆盖率较高可达 88以上不同有效抗原组合的发生频率不同在中国患儿中的表达 与 国 外 报 道 有 差 异其 中CD21/CD10/CD34/CD19 CD22/CD10/CD34/CD19CD10/CD56/CD34/CD19TdT/Cu/CD34/CD19 组合的表达率略低于国外报道 TdT/CD10/CD34/CD19 的表达高于国 外 报 道而CD38/CD10/CD34/CD19CD45/CD19
5、/CD10/CD34 CD58/CD10/CD34/CD19CD66c/CD10/CD34/CD19 的表达率与国外报道 的发生频率范围基本一致2TdT/CD10/CD34/CD19 有高表达频率 可作为简化的 MRD 检测目标组合3发生频率较高的 4 个抗体组合 CD38/CD10/CD34/CD19CD45/ CD10/CD34/CD19 CD58/CD10/CD34/CD19 和 TdT/CD10/CD34/CD19 可以协助无初发 MRD 记录的患儿的疗效评估和指导治疗强度调整4部分有效抗体组 合 对 临 床 预 后 产 生 影 响CD58/CD10/CD34/CD19和 TdT/CD
6、10/CD34/CD19 与良好预后相关CD66c/CD10/CD34/CD19 和 CD38/CD10/CD34/CD19 与不良预后相关该结果可能为 B-ALL 的个体 化治疗提供参考依据 关键词 白血病 B 细胞急性, 流式细胞术, 儿童, 有效抗原组合 第二部分 高分辨熔解曲线法检测 FLT3 的方法建立及临床意义的初步研究 目的 目的 构建 FLT3 质粒及建立荧光实时定量 PCR 聚合酶链式反应 RQ-PCR 高分辨熔解曲线 HRM 检测儿童急性髓细胞白血病 AML 骨髓样本 FLT3 基因的实验方法 初步研究 FLT3 基因在儿童急性髓细 胞白血病中的发生频率及临床意义 方法 方
7、法 参考国内外文献设计合成 FLT3-ITD 基因引物利用分子克隆 的方法构建含有目的基因 FLT3-ITD 突变型和野生型片段的质粒并 以此作为阳性和阴性对照检测儿童急性髓细胞白血病的骨髓样本 通 过实时荧光定量 PCR 高分辨熔解曲线分析的方法 对质粒和临床样本 进行检测根据该基因野生型和突变型 PCR 扩增产物解链温度的差 异对样本和质粒的不同基因型进行区分实验结果应用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理计数资料采用卡方检验计量资料采用方差分 析 结果 结果 70 例我院明确诊断并接受治疗的初发急性髓细胞性白血病患儿 的骨髓标本中有 23 例标本存在 FLT3-ITD 突变突变率为
8、32.86% FLT3-ITD 突变组与野生组之间的起病临床因素如年龄性别比例 初发时骨髓原始细胞比例白细胞计数血小板计数是否存在髓外 浸润LDH 水平SF 水平间无显著的统计学差异FLT3-ITD 突变的 发生率 M2M3M4/M5M1/M7M6,该突变在 7 种常见儿童急性髓细胞白 血病分型中的分布无显著的统计学差异P=0.061.尽管 FLT3-ITD 突 变组的一疗程缓解率EFS 和 OS 均低于 FLT3-ITD 野生组但两者的 差异未达到统计学标准P0.05. 结论 结论 本实验构建的包含 FLT3-ITD 基因突变型和野生型的质粒作为 RQ-PCR 的阳性和阴性对照具有临床应用意
9、义为高分辨熔解曲线 的分析提供了基础条件 建立了荧光实时定量 PCR 高分辨熔解曲线分 析检测儿童急性髓细胞性白血病初发患儿 FLT3-ITD 突变的方法可 能为进一步检测微小残留病变提供参考依据FLT3-ITD 突变型与野 生型患儿的临床预后指标之间的差异未达到统计学标准 该突变发生 的预后意义有待进一步研究 关键词 FLT3-ITD 质粒RQ-PCRHRM儿童急性髓细胞性白血病 ANTIGENS ABNORMAL EXPRESSION AND GENE MUTATIONS IN PEDIATRIC ACUTE LEUKEMIA ABSTRACT PART I CLINIC RESEARCH
10、 ON EFFECTIVE ANTIGEN COMBINATIONS IN CHILDHOOD B LINEAGE ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA Objective To probe into the occurrence frequencies of the effective antigen combinations which were used to detect the Minimal Residual Disease (MRD) by flow cytometry in childhood B-lineage Acute Lymphoblastic Le
11、ukemia (B-ALL), as well as the relationship between clinic-biologic factors and different combinations. Methods Among the 327 B-ALL children enrolled in our study, 289 cases were identified with at least one antigen combination as MRD marker. We monitored their bone marrow samples using 9 combinatio
12、ns with 4 antigens each, analyzed the occurrence frequencies and compared them with international reports. Also the differences in the distribution of each antibody combination in the different clinic-biologic groups were compared by the chi-square test and Fishers exact chi-square test. Results (1)
13、 327 cases of childhood BALL were screened for antibody combinations of interested and 88.4 percent of them (289 cases) were identified with effective antibody combinations. (2) The occurrence frequencies of antigen combinations were different. The highest frequency goes to TdT/CD10/CD34/CD19 combin
14、ation which is 70.59 percent. Expressions of antigen combinations in Chinese children were different from western countries. (3) Some antibody combinations present different frequency among different clinical groups. Results showed that CD38/CD10/CD34/CD19 expressed more often in samples of relapsed
15、 patients (P=0.045). CD66c/CD10/CD34/CD19 expression was significantly higher in BCR/ABL positive group (P=0.037) and relapsed patients group (P=0.047). TdT/CD10/CD34/CD19 is expressed more in MLL-AF4 negative group (P=0.005) and Prednisone Good Response group (P= 0.002). CD58/CD10/CD34/CD19 was cor
16、related with low relapse rate (P=0.032). Conclusion 1The coverage rate of 9 antigen combinations in our study was 88.4%. The occurrences of frequency of different antibody combinations in B-ALL were different, and also different from that from western countries. The occurrence frequencies of antibody combinations CD21/CD10/CD34/CD19, CD22/CD10/CD34/CD19, CD10/CD56/CD34/CD19 and TdT/Cu/CD34/CD19 were lower than the western report, while CD38/CD10/CD34/CD19, CD45/CD19/CD10/CD34, C
