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1、山东师范大学硕士学位论文 1 学号：2008021127 姓名：于芹 联系电话：18660145056 E-mail：yuqin6810 所在学院：生命科学学院 山东师范大学硕士学位论文 2 单位代码单位代码 10445 学学 号号 2008021127 分分 类类 号号 Q291 研究生类别研究生类别 全日制硕士全日制硕士 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 论文题目论文题目: 在飞蝗两型转变中在飞蝗两型转变中 takeout 蛋白蛋白 功能的研究功能的研究 学科专业名称：细胞生物学学科专业名称：细胞生物学 申请人申请人 姓姓 名：于芹名：于芹 指指 导导 教教 师：安利师：安利国国 教授教
2、授 康乐康乐 研究员研究员 王宪辉王宪辉 副研究员副研究员 论文提交时间：论文提交时间：2011 年年 4 月月 19 日日 独独 创创 声声 明明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 （注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 导师签字： 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全
3、了解 学校学校 有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权 学校学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在 解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期：签字日期： 年年 月月 日日 签字日期：签字日期： 年年 月月 日日 山东师范大学硕士学位论文 i 目目 录录 摘 要 I 论文分类号：Q291 II Abstract III 英文缩略词表 V 综述 . 1 1 飞蝗概述 1 2 飞蝗的型变 1 3 昆虫
4、 takeout 蛋白研究进展 5 4 本课题研究的背景、内容和意义 . 11 正文 . 14 第一章 LimgTO2 的序列分析. 14 1 材料与方法 14 2 实验结果 15 3 讨论19 第二章 LimgTO2 在群居型和散居型飞蝗中的表达差异. 21 1 实验材料 21 2 试剂和仪器 21 3 实验方法 22 4 实验结果 . 31 5 讨论35 第三章 群居化和散居化过程中 LimgTO2 在飞蝗后腿组织表达的变化 36 1 实验材料 36 2 实验方法 37 3 实验结果 37 4 讨论 40 第四章 LimgTO2 在散居型飞蝗后腿组织的分布. 41 1 实验材料 41 2
5、试剂及仪器 41 3 实验方法 41 4 实验结果 43 5 讨论 45 结 论 . 47 参考文献 . 48 致 谢 . 54 攻读硕士学位期间发表的文章 . 55 山东师范大学硕士学位论文 I 摘 要 飞蝗是一种分布广泛的农业害虫，遍布欧、亚、非、澳四大洲。在我国也广 泛分布。飞蝗具有两型现象，分为散居型和群居型，且两型在不同环境条件下可 以相互转变，散居型向群居型转变并且集聚迁飞是蝗灾爆发的主要原因。 takeout 家族是昆虫在长期进化过程中形成的一个特有的、大的蛋白家族， takeout 包括大约 250 个氨基酸，是一类分泌蛋白，主要分布于涉及化学感受和 营养的组织，例如果蝇的触角
6、、下唇须、脂肪体及前胃等。其主要功能是参与节 律调控， 调节昆虫摄食与运动， 参与味觉和嗅觉系统的化学感受， 参与性别分化， 有助于雄性果蝇求偶等。许多学者认为 takeout 蛋白具有配体结合特征，它会与 不同的疏水配体结合从而执行不同的生理功能，但是没有直接证据。 最近有资料表明在群居型飞蝗散居化和散居型飞蝗群居化过程中共有 453 条共同差异表达的基因，包括多个 takeout 基因，其中一个 takeout 基因 LimgTO1 被认为通过接收其它个体的化学信号， 从而产生应答参与型变过程， 但 对于其他 takeout 基因与飞蝗型变的关系尚不清楚。 本研究选取其中一个 takeou
7、t 基因LimgTO2，以四龄第三天的蝗蝻作为 研究对象。首先对其进行信号肽预测，发现其具有信号肽序列；进行进化分析， 发现 LimgTO2 属于 takeout 家族；进行序列比对分析，发现在 N 端具有两个保 守的 Cys 残基，推测其可能具有配体结合特征。第二，通过实时荧光定量 PCR 技术和Western blot方法检测LimgTO2在两型飞蝗的表达， 发现散居型飞蝗后腿、 翅膀、触角的表达量明显高于群居型，尤其是后腿的差异量最大，而 LimgTO2 在两型飞蝗的其他组织中均没有表达。第三，同样用实时荧光定量 PCR 技术和 Western blot 方法检测检测两型转化过程中的 L
8、imgTO2 的表达变化，结果显示 LimgTO2 在散居型飞蝗群居化过程中表达量下降；在群居型飞蝗散居化过程中 表达量上升，表明后腿中 LimgTO2 可能参与两型转变。最后，用实时荧光定量 PCR 方法、Western blot 方法和免疫组织化学方法共同检测，发现 LimgTO2 位于 散居飞蝗的后腿腿节的表皮，推测 LimgTO2 蛋白可能作为载体蛋白参与后腿表 皮感受器感受外界信号，从而进一步影响型变。 国内外许多学者对蝗灾及飞蝗两型转变的机制进行了大量研究， 但很少深入 山东师范大学硕士学位论文 II 到分子生物学层面，本实验从分子生物学角度对飞蝗两型转变的机制进行研究。 目前治理
9、蝗灾的方法主要集中于大规模使用化学药物， 但这些药物会导致环境污 染，生态破坏等问题，而本实验为人类从生物学角度控制蝗灾奠定了基础。 关键词：关键词：LimgTO2 蛋白；散居型飞蝗；群居型飞蝗；群居化；散居化 论文分类号：论文分类号：Q291 山东师范大学硕士学位论文 III Functional Analysis of takeout Protein in the Phase Transition of Locusta migratoria Abstract The migratory locust, Locusta migratoria, is a widespread pest tha
10、t is distributed in Europe, Asia, Africa, and Australia. They also have a broad distribution in China. In L. migratoria, there are two phases, solitarious and gregarious phases, which can transform into the other. Locust outbreaks are mainly caused by the transform of the solitarious into the gregar
11、ious phase and the formation of swarm bands. Takeout family is a big insect-specific protein family formed during long evolution. They are secretary proteins containing about 250 amino acids. Takeout proteins are abundantly distributed in several tissues related to chemical sense and nutrition, for
12、example, antennae, tarsi, fat body and cardia. So far, they are revealed to be involved in circadian rhythm, feeding and locomotor activity, chemical sensation, sex-determination, and male courtship behavior. Many scholars thought that takeout proteins could bind different hydrophobic ligands which
13、could perform different functions, but there were no direct evidence. Recent research revealed that, during solitarization and gregarization of L. migratoria, the expression of 453 genes differed significantly, including many takeout genes. Among these takeout genes, LimgTO1 is proposed to accept si
14、ngals from other individuals causing phase change, but the relationship between other takeout genes and phase change remains unclear. We analyzed the third-day fourth instar nymphs using LimgTO2, which is one of the above takeout gene families. The signal peptide prediction revealed that LimgTO2 pos
15、sesses signal peptide sequence. Phylogenetic analyses supported that LimgTO2 belongs to the takeout family. The two Cys residues in the N terminus indicated that LimgTO2 could bind ligands. The tissue-specific expression and differential expression profiling of the LimgTO2 gene during phase transiti
16、on of L. migratoria were analyzed by real-time quantity PCR and Western blot. The gene had a 山东师范大学硕士学位论文 IV significantly higher expression level in solitarious locusts than gregarious locusts, with the most different expression in the tissue of hind legs. The expression of LimgTO2 was down-regulated during the gregarizaiton process and up-regualted during the reverse process. The above re
