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1、福建医科大学 硕士学位论文 兔棘阿米巴性角膜炎IL-1和MCP-1的表达 姓名：林秀丽 申请学位级别：硕士 专业：眼科学 指导教师：朱学军 20100301 兔棘阿米巴性角膜炎I L 11 3 和M C P 1 的表达 中文摘要 目的建立一种模拟临床人角膜感染棘阿米巴的动物模型，对其角膜组织损伤的临床表 现和组织病理学改变进行观察，同时探讨角膜棘阿米巴原虫感染后角膜炎症细 胞因子M C P 1 、I L 11 3 的表达。 方法4 0 只新西兰白兔，应用角膜表面镜片术法，即刮除角膜上皮，覆盖角膜植片， 二者层问注入棘阿米巴滋养体混悬液，缝合眼睑2 4 h ，建立棘阿米巴角膜炎模 型，并观察角膜
2、溃疡形态，行角膜H E 染色或P A S 染色组织病理切片检查，并 应用逆转录聚合酶链式反应( R T - P C R ) 技术，检测不同病程角膜组织中的I L 一11 3 、 M C P 1 的表达。 结果4 0 只兔子右眼均感染棘阿米巴性角膜炎，并经角膜刮片及培养、组织病理切片 染色检查证实。感染眼角膜出现水肿，环形基质浸润，角膜新生血管等表现； 其病理组织切片上可见基质层内的棘阿米巴滋养体或包囊，伴有中性粒细胞， 单核巨噬细胞，嗜酸性粒细胞等的浸润。实验组右眼病变角膜组织中，I L 11 3 含量于感染后第1 天、第3 天、第5 天均有大量表达，于感染后第3 天表达量 达到高峰，第7 天
3、后呈现逐渐下降趋势，与角膜炎症程度趋势一致( P 7 5 记4 分；基质混浊程度分为3 级：l 级雾状混浊可见虹膜纹理，2 级灰白色混浊， 可隐约见虹膜，但看不清虹膜纹理，3 级完全看不见虹膜。 2 4 2 病原学检查 分别在感染后的第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天、第1 4 天行病原学检测。用无菌 1 2 棉签拭去兔角膜病灶表面分泌或坏死组织后，无菌条件下采用消毒的一次性显微手术 刀片刮取角膜病变组织，刮片物制成1 0 氢氧化钾( K O H ) 湿片和革兰染色涂片分别进 行棘阿米巴原虫检查和细菌检查。同法刮取角膜病变组织，部分刮片物被接种于涂有 灭活大肠杆菌的N N A 平
4、板，置于2 8 温箱进行培养，另外一部分刮片物接种于血平皿， 置于3 7 进行细菌培养，培养1 4 天，每天观察生长情况。 2 4 3 组织病理学检查 分别于术后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天、第1 4 天、第2 8 天各时相，取5 只兔 子行裂隙灯显微镜检查并照相，经临床评分后耳缘静脉注射1 0 m l 空气处死，取兔子眼 角膜，无菌条件下按手术步骤摘除眼球，取下角膜，将其一分为二，一半置于1 0 中 性福尔马林固定液中固定，切片分别行苏木素伊f Z ( H E ) 染色或过碘酸S c h i f f ( P A S ) 染色，光学显微镜下进行分析。另一半放入经过高压消毒并
5、且D E P C 处理过的E P 管中， 立即于- - 7 0 深低温冰箱保存，手术操作过程中均避免核糖核酸酶和其他物质污染。 切片制作步骤 1 ) 固定、脱水、透明：标本于中性固定液中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明5 1 0 分钟： 2 ) 包埋：6 5 浸蜡过夜，石蜡包埋； 3 ) 切片：从中央角膜开始连续切片，切片厚度为4l - tm ； 4 ) 脱蜡：烘干后二甲苯脱蜡1 5 分钟。 常规H E 染色步骤 1 ) 石蜡切片经二甲苯常规脱蜡后，梯度酒精( 1 0 0 、9 5 、8 0 、7 0 、5 0 ) A 水； 2 ) 苏木素染色1 5 分钟； 3 ) 蒸馏水冲洗2 分钟； 4 )
6、 4 1 盐酸酒精酸化数秒钟，流水冲洗，1 氨水中止酸化； 5 )自来水冲洗3 0 分钟，蒸馏水洗2 次： 6 16 1 伊红染色2 3 分钟： 7 ) 脱水：8 0 、9 5 、10 0 酒精各脱水2 分钟； 8 ) 透明：石炭酸二甲苯2 分钟，二甲苯2 分钟； 9 ) 中性树胶封片：光镜下观察组织结构变化以及炎性细胞浸润情况并照相。 高碘酸S c h i f f ( P A S ) 染色步骤 1 ) 切片脱蜡至水后，1 过碘酸氧化1 0 分钟，蒸馏水充分洗净； 2 ) S c h i 蹴剂染1 0 2 0 分钟，偏重硫酸钠浸泡数秒； 3 ) 自来水冲洗1 0 分钟，蒸馏水充分沈净； 4 )
7、 然后依次置于8 0 、9 5 、1 0 0 酒精逐级脱水各2 分钟； 5 ) 再入石炭酸二甲苯及二甲苯各2 分钟； 6 ) 最后用中性树胶封片，光镜下观察并照相。 组织病理切片观察项目有： ( 1 ) 炎症反应，包括炎症细胞的有无、细胞类型、炎症范围、深度和炎症细胞的分布。 ( 2 ) 棘阿米巴原虫在感染角膜中的位置及其在H E 染色，P A S 染色下的形态。 2 5 统计学分析 研究数据采用S P S S16 0 统计学软件进行统计处理。对感染动物的临床评分等应用参 数检验中方差分析及t 检验进行统计学处理，以P 0 0 5 为差别有统计学意义。 1 4 实验结果 3 1 临床表现 4
8、0 只新西兰大白兔实验组右眼全部形成角膜基质炎，其中有2 4 例出现环形角膜基质浸 润( 约6 0 ) ，7 例出现前房积脓( 约1 7 5 ) ，3 例出现角膜穿孔( 约7 5 ) ，对照组左眼 眼未见感染。实验眼感染后第1 3 天，裂隙灯显微镜下可见实验眼结膜混合充血，分泌 物较多，角膜弥漫性点状混浊，表面呈不均匀的颗粒状粗糙外观，虹膜纹理及细节不 能分辨；实验眼后第3 5 天，球结膜充血水肿，结膜囊内分泌物增多，病变密度增高， 基质浸润，出现不均匀狄白色混浊，表面可见分泌物，前房难以窥清，未见角膜坏死 组织及溃疡形成；实验眼感染后第5 9 天，结膜水肿减轻，而充血加重，分泌物增多， 出现
9、角膜环形基质浸润，表面角膜组织坏死，溃疡形成，少部份出现前房积脓甚至穿 孔，少量新生血管开始自角膜缘向溃疡病灶内长入；实验眼感染后第1 4 2 8 天，分泌物 逐渐减少，结膜充血减轻，角膜溃疡灶局限，水肿减轻，角膜新生血管化，形成角膜 血管翳。( 图l a 1 h ) 。 3 2 临床表现评分 根据临床评分标准，对实验组感染后的7 个时间点的角膜病变进行了临床评分( 表1 ) ， 各时间点总评分为( 又s ) ：第l 天4 2 6 士0 3 1 ，第3 天7 1 2 士0 8 1 ，第5 天8 8 9 士0 7 3 ，第7 天7 3 5 士0 7 2 ，第9 天6 9 7 士0 5 2 ，第1
10、 4 天5 3 3 士0 1 7 ，第2 8 天2 5 3 士0 3 8 。分析评分结果可 见，感染后第3 天至第7 天，临床得分最高，角膜溃疡、基质混浊最严重；第9 天后角膜 溃疡逐渐局限，角膜以新生血管翳及角膜瘢痕为主要表现。 表1各时间点兔棘阿米巴角膜炎临床表现评分 T a b l elT h ec l i n i c a ls c o r eo f A c a n t h a m o e b ak e r a t i t i si nd i f f e r e n tt i m e | 璺| J a ：正常兔角膜； b ：第1 天，角膜点状混浊水肿： c ：第3 天，角膜基质浸润： d
11、 ：第5 天，环形角膜基质浸润： e ：第7 天角膜溃疡伴前房积脓； 第9 天，环形角膜基质浸润 伴角膜缘新生血管； g ：第1 4 天，角膜血管翳： h ：感染第2 8 天角膜新生血管变细 溃疡灶局限缩小( 2 0 0 1 。 F i g u r e l a ：N o r m a lr a b b i tc o r n e a ； b ：t h el t hd a y , e d e m ai nc o m e a ； c ：t h e3 t hd a y , m f i l l r a t ei ns t r o m a l ； d ：t h e5 t hd a y , r i n gi
12、n f i l t J a t ei ns t r o m a l ； e ：t h e7 t hd a y , C o r n e a lu l c e r w i t hh y p o p y o n ； f ：t h e9 t hd a y , r i n gm f i l t r a t ei n s t r o m a lw i t hN e o v a s c u l a r i z a t i o n ； g ：t h e1 4 t h d a y , C o m e a lp i n u s ； h ：t h e2 8 n d d a y , T h i n n e r c o
13、 r n e a l n e o v a s c u l a r i z a t i o n , u l c e rl e s i o n s c o n f u t e dt on a r r o w ( x 2 0 0 ) 零 ， 麟 3 3 病原学检查结果 术后第1 天、第3 天、第5 天，第7 天实验眼角膜物刮片行1 0 K O H 湿封片检查，均 可在镜下检出包囊( 图2 ) ，第9 天，第1 4 天角膜刮片物检查均为阴性，对照眼所有时间 差点的角膜刮片物涂片镜检均未见滋养体或包囊，所有时间点的角膜刮片革兰染色检 查未见细菌。 图2 实验眼角膜刮片1 0 K O H 湿封片镜检可见棘
14、阿米巴胞囊，直径约1 0 3 0 u m ， 均可观察到双层囊壁，外囊壁多呈皱褶状，内层囊壁呈波浪形或多边形( X 4 0 0 ) 。 3 4 阿米巴原虫培养结果 在倒置显微镜下观察，在培养后2 - - 3 天，可见大量滋养体生长( 1 5 3 ) ，对照组培 养阴性，细菌培养1 4 天，未见细菌生长。 图3 角膜刮片物培养3 天后可见大量的滋养体生长，棘阿米巴滋养体为卵圆形或长条 形，其大小约为3 5 4 5 u m ，中央或偏中央有一亮点，有变化多样的棘状伪足( x 4 0 0 ) 。 3 5 组织病理学改变 3 5 1 炎症反应 正常兔角膜上皮细胞及基质胶原纤维排列整齐、规则，无炎症细胞
15、浸润及新生血管。 与正常的兔角膜相比，实验组右眼感染后第1 - 3 天，角膜上皮缺如，角膜水肿增厚明显 上皮下基质结构疏松，胶原纤维排列紊乱，可见大量的单核巨噬细胞，伴中性粒细胞 及嗜酸性粒细胞浸润。感染后第5 7 天，角膜再生上皮鳞状细胞摊列紊乱，厚薄不一。 角膜水肿减轻病灶区基质层纤维出现坏死溶解，大量中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸 润，周边呵见少量成纤维细胞增生，少量新生血管形成。感染第9 2 1 天，角膜上皮F 可见胞核深染、小而圆的淋巴细胞浸润，中性粒细胞减少，角膜基质层纤维排列紊乱。 大晕的纤维结缔组织增生形成肉芽肿，使角膜感染区增厚明显可见大量新生血管， 血管腔内可见红细胞及巾性多形
16、核白细胞。感染后第2 8 天，角膜上皮层已基本修复完 整，摹底层细胞增生增高呈柱状，角膜基质纤维捧列不规则，病灶周边可见新生血管， 少量炎性细胞浸润f 图4 a - 4 d ) 。 图4 搏染后兔角膜病理切片H E 染色。4 a ：感染后第2 4 + 时，角膜上皮缺损，基质水肿， 伴有中性粒细胞及单核巨噬细胞浸润；4 b ：感染后第7 天；角膜组织出现坏死，基质混 浊严重( 1 0 0 ) 。4 c ：感染后第1 4 天角膜上皮愈合，角膜基质内可见成纤维细胞增 殖和大量新生血管。( 1 0 0 ) ：4 d ：感染后第2 8 天角膜厚薄不均，成纤维细胞明显增生 ( 1 0 0 ) 。 F i 9 4 H Es t a i n o f i n f e c t i o nc o r n e a l F i 9 4 a ：C o m e a le d e m a a a de p i t h e
