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1、分类号： 密级： 单位代码： 学号： 1 0 1 1 4 2 0 1 0 3 0 9 5 8 兔角膜缘干细胞体外无血清培养 及生物学特性研究 研究生： 指导老师： 申请学位门类级别： 专业名称： 研究方向： 所在学校： 黄晓梅 马蕾副教授 医学硕士 眼科学 眼屈光及年龄相关眼 第二临床医学院 2 0 1 2 年5 月6 日 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引 用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的
2、任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1 、交回学校授予的学位证书； 2 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道 歉。 4 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名： 垄鏖釜昏 日期：坦2 笔一一土 学位论文版权使用授权书 日 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索
3、，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位 仍然为山西医科大学。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：二羹l 笔仁 指导教师签名： ( 本声明的版权 日期：尘世屯上月粤日 日期：必肛年。月2C 日 ，未经许可，任何单位及任何个人布得擅自使一芑岁一_ 7 一 山西医科大学硕士学位论文 目录 摘要I A B S T R A C T I I 前言1月U 吾 材料与方法2 结果4：口木+ 讨 仑6 结论9 附图1 0 参考文献1 2 综述15 参考文献2 0 个人简介2 3 致谢一2 4 山西
4、医科大学硕士学位论文 兔角膜缘干细胞体外无血清培养及生物学特性研究 摘要 目的：在不添加血清( 2 B 2 7 代替血清) 的条件下对新西兰大白兔( N e w Z e a l a n dR a b b i t ) 角膜缘干细胞进行培养，观察所培养的干细胞的生物学特性，并与传统添加血清( 浓度为 1 0 ) 培养的兔角膜缘干细胞进行比较，进而探讨兔角膜缘干细胞体外无血清培养方法， 为构建组织工程化角膜及角膜基础研究积累实验资料。 方法：( 1 ) 无菌条件下获取兔角膜缘组织，采用酶消化法( D i s p a s eI I ) 制成单细胞悬液， 然后分别用含2 B 2 7 ( 无血清组) 及1
5、 0 胎牛血清( 1 0 血清组) 的D M E M F 1 2 ( 1 ：1 ) 培养 液稀释成等密度的细胞悬液。( 2 ) 将两组细胞悬液直接接种于培养瓶( 倒置显微镜下观察 两组细胞的生长情况) 或9 6 孔板( C C K 8 检测其克隆增殖能力) 。( 3 ) 原代培养至第3 天、 第5 天行A N p 6 3 及角蛋白K 3 ( A E 5 ) 免疫荧光染色，分别对培养的两组细胞进行干细胞鉴定 并进一步进行比较。 结果：( 1 ) 于倒置显微镜下观察可见含2 B 2 7 的无血清组培养的兔角膜缘干细胞表现 出与传统含1 0 胎牛血清的1 0 血清组培养的角膜缘干细胞相似的生长特性。
6、( 2 ) C C K 8 细胞增殖能力检测所得细胞生长曲线显示两组细胞表现出相似的增殖能力：对数增殖期大 约在第3 5 天，之后增殖缓慢进入生长平台期。( 3 ) 细胞免疫荧光染色显示含2 B 2 7 的 无血清组培养的兔角膜缘干细胞中大多数细胞d N p 6 3 表达阳性而角蛋白K 3 ( A E 5 ) 表达阴 性，且与传统1 0 血清组培养的角膜缘干细胞相比，原代培养第3 天A N p 6 3 表达阳性率 相似( P 0 0 5 ) ，原代培养第5 天A N p 6 3 阳性率略高( P 0 0 5 ) ，见表1 。 原代培养第5 天，两组细胞仍大部分表达A N p 6 3 ( 见附图
7、7 、8 ) ，少部分表达角蛋白 K 3 ( 见附图9 、1 0 ) 。无血清组较1 0 血清组A N p 6 3 阳性率稍高，且差异有统计学意义( P 0 0 0 1 ) ；角蛋白K 3 阳性率1 0 血清组表达明显高，其两组比较差异有统计学意义( P O 0 0 1 ) ，见表1 。 4 山西医科大学硕士学位论文 阳性率( X + S ) AN p 6 3 3 d 5 d 角蛋白K 3 3 d 8 4 3 9 - t - 2 7 78 4 13 士2 6 2 8 2 6 1 + 1 4 5 7 5 3 9 土2 3 0 1 2 9 1 + 2 1 51 4 3 8 + 1 2 4 p =
8、0 6 5 9 p O 0 5 ) ；细胞 培养至第5 天时，两组细胞角蛋白K 3 阳性率升高、A N p 6 3 阳性率降低，1 0 i 缸清组角蛋 白K 3 阳性率高于无血清组( P o 0 0 1 ) 、A N p 6 3 阳性率明显低于无血清组，表明无血清培养 可能更利于维持干细胞细胞的未分化状态。 山西医科大学硕士学位论文 结论 一、采用细胞悬液法可成功分离获得新西兰兔角膜缘干细胞； 二、使用成分明确的1 B 2 7 代替血清可成功培养出兔角膜缘干细胞，且培养所得干细 胞一般生长特性与使用胎牛血清培养所得干细胞基本相似； 三、无血清培养可以更好的维持兔角膜缘干细胞的未分化状态。 糍
9、搿毪 。魄 ， 譬 孵 1 1 【 柙 箩 。、 。 静 静 霰 # # 、 、黪 矿 ，一穆聋 肇 辍 母 赫 谚 舔 帮撬 山西医科大学硕士学位论文 附图7 ：无血清组角膜缘干细胞原代培养 第5 d A N p 6 3 染色( F I T C 2 5 0 ) 附图9 ：无血清组角膜缘干细胞原代培养 第5 d 角蛋白K 3 染色( F I T C 2 5 0 ) 附图8 ：1 0 血清组角膜缘干细胞原代培养 第5 d A N p 6 3 染色( F I T C 2 5 0 ) 附图1 0 ：1 0 血清组角膜缘干细胞原代培养 第5 d 角蛋白K 3 染色( F I T C 2 5 0 ) 一
10、 些堕垦型奎堂堡主堂垡垒苎 参考文献 1 D u a h s ，A z u a r - B l a n c o a L i m b a ls t e mc e l l so ft h ec o r n e a le p i t h e l i u m J S u r vO p h t h a l m o l ，2 0 0 0 ，4 4 ( 5 ) ：4 15 - 4 2 5 2 D uY , c h e nJ , F u n d e r b u r g h 儿，e ta 1 F u n c t i o n a lr e c o n s t r u c t i o no fr a b b i t
11、c o r n e a l e p i t h e l i u m b yh u m a nl i m b a lc e l l sc u l t u r e do na m n i o t i cm e m b r a n e J M o lV i s ，2 0 0 3 ，9 ：6 3 5 6 4 3 3 K i mM K ，H e oJ W , L e e 儿，e ta 1 A d h e s i o nc o m p l e xi nc u l t i v a t e dl i m b a le p i t h e l i u mO na m n i o t i cm e m b r a
12、 n ea f t e ri nv i v ot r a n s p l a n t a t i o n J C u r r E y eR e s ，2 0 0 5 ，3 0 ( 8 ) ：6 3 9 6 4 6 4 S a n t o sM S ，G o m e sJ A ，H o f l i n g - L i m aA L ，e ta 1 S u r v i v a la n a l y s i so fc o n j u n c t i v a ll i m b a l g r a f t sa n da m n i o t i cm e m b r a n et r a n s p
13、l a n t a t i o ni ne y e sw i t ht o t a ll i m b a ls t e mc e l ld e f i c i e n c y J A m JO p h t h a l m o l ，2 0 0 5 ，1 4 0 ( 2 ) ：2 2 3 2 3 0 5 S e h l o t z e r - S c h r e h a r d tU ，K _ r u s eF E I d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fl i m b a ls t e mc e l l
14、 s J E x pE y eR e s ，2 0 0 5 ，81 ( 3 ) ：2 4 7 2 6 4 6 C h e eK Y , K i c i cA ，W i f r e nS J L i m b a ls t e mc e l l s ：t h es e a r c hf o ram a r k e r J C l i nE x p e f i m e n t O p h t h a l m o l ，2 0 0 6 ，3 4 ( 1 ) ：6 4 7 3 7 L iW ，H eH ，K u oC L ，e ta 1 B a s e m e n tm e m b r a n ed i s s o l u t i o na n dr e a s s e m b l yb yl i m b a l c o m e a le p i t h e l i a lc e l l s e x p a n d e do na m n i o t
