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1、病毒检验技术,Virus Detection Technology,前言,目 录,CONTENTS,病毒的分离与培养,免疫学方法,病毒核酸分子检测,新型核酸扩增检测技术,前言,01 PART,病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等）进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。,病毒检验技术,病毒检测技术反映病毒的核酸水平、感染的状态、传染性和评定治疗效果，对病情的诊断、治疗和用药上起着关键性的作用，可根据检查结果判断和选择患者适宜的抗病毒药物种类，并制定适宜的最佳治疗方案；可根据病毒核酸量
2、的动态变化对患者用药的剂量、时间及是否需要联合用药等提供重要的参考依据。病毒检测技术在评价和观察抗病毒药物治疗的疗效、免疫增强药物的疗效及判定预后效果都有重要应用。,病毒检验技术流程,病毒的分离与培养,主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,02 PART,细胞培养法,细胞培养瓶,鸡成纤维细胞,二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等；原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞，原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养；传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞。,鸡胚培养
3、,鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。,一般选用914d的鸡胚,优点: 来源充足、 组织分化程度低、 本身很少携带病毒和细菌、 对接种病毒不产生抗体及 病毒较易增殖等,不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大，选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种,尿囊腔接种：常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养,动物接种,常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等； 常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻
4、腔及脑内接种等方式；,病毒增殖的观察,病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 2红细胞吸附 3细胞培养液pH值改变 病毒数量及病毒感染性测定 1血凝试验 2中和试验 3空斑形成试验 4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）,红细胞吸附,包涵体,细胞形态改变,光学显微镜,形态学检查及诊断,直接观察到较大的病毒体（如痘病毒） 、包涵体 狂犬病毒感染嗜酸性包涵体。,扫描电子显微镜,用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等 。,透射电子显微镜,用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等。,空斑形成试验,是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培
5、养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。 每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位 (plaque forming unit, PFU)。 病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,免疫学方法,03 PART,ELISA,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）采用抗原与抗体的特异反应将待
6、测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。,病毒核酸分子检测,04 PART,基因芯片,基因芯片(gene chip)又称基因微矩阵(DNA microarr
7、y)具有微型化、高通量 、并行处理易于自动化等优越性,它将大量的靶基因片段有序、高密度地排列在玻片、硅等载体上, 用荧光检测后 , 通过计算机软件进行数据比较和分析 ,一次试验就可对上万种基因进行快速、准确 、高效的检测。,实时荧光定量 PCR,目前最有效、最灵敏的方法就是实时荧光定量 PCR（real time RT-PCR），根据目标核酸基因来设计引物实现对靶标的检测，已广泛应用在临床样品的检测。real time RT-PCR 是将荧光能量传递技术应用于 PCR 仪中，在PCR 的反应体系中加入荧光基团，利用获取的荧光信号积累来实时监测整个 PCR 进程，最终通过得到的标准曲线对未知得模
8、板进行定量分析的方法。,新型核酸扩增检测技术,05 PART,NASBA,NASBA（Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依赖性扩增检测技术）是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法。该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。 相对于免疫学方法或其他基因检测法，NASBA速度快，特异性强，敏感性高，检测范围广泛，缺点在于成本较高。,杂交链式反应HCR,杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction, HC
9、R）是由 Dirks 与 Pierce于 2004 年提出的一种高效的核酸扩增方法，根据核酸探针竞争性杂交形成长度不等的亚稳态核酸双链实现输出信号的放大。HCR 反应在室温下即可，无需变温调节、酶的辅助及其它试剂的参与，在核酸信号扩增方面得到广泛应用。HCR 反应体系由一段启动探针 I，两段发夹环结构探针 H1、H2 构成，H1 与 H2 发夹环探针结构相似，分为环部、茎部以及粘性末端三个部分，启动探针引发两段功能性核酸探针竞争性结合，形成亚稳态的核酸双链，从而实现 HCR 反应。,HCR 介导的比色方法,比色法主要通过颜色的变化来实现对目标物的检测。 将 HCR 反应与形成G-四连体结构结合
10、用于检测一段 TBV 寡核苷酸序列。,HCR介导的荧光检测方法,荧光因其特有的发光性质，可通过仪器检测荧光信号值的变化实现对目标物质的实时监测，结合 HCR 信号扩增技术后会将信号放大输出，实现更加灵敏的检测。,基于 HCR 介导的核酸检测方法,HCR 介导的纳米金方法,当靶标与两段探针通过 HCR 反应结合不断形成核酸双链结构，核酸探针就会从纳米金上脱落下来，使得纳米金在盐溶液中发生聚集，溶液呈现蓝色。通过肉眼观测到溶液颜色的变化，实现了核酸可视化的检测。,HCR 反应与电化学方法相结合,发夹环核酸探针固定在电极上，通过与待检靶标以及核酸引物碱基互补后，在 dNTP 与聚合酶作用下，循环形成多个带有可启动 HCR 序列的引物，与标记Biotin的 H1、H2 进行 HCR 反应，特异性与标记 SA 的碱性磷酸化酶在电极上产生电信号，从而实现对靶标的检测。,自动化,高通量,可视化,集约化,规模化,病毒检测技术中核酸检测可直接对病毒基因进行检测，避免抗原和抗体检测的窗口期漏检，而且基本上可以检测微量病毒基因，这是抗原和抗体检测试剂不能比拟的。同时病毒检测技术正趋向大型化、集约化、规模化、自动化、高通量筛选，一次获得多个相关病原体信息，并能分析、鉴别所获得的检测结果。利用荧光实时PCR和NASBA同时检测多种病毒或是未来发展的主要方向。,展望,THANKS,
