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1、食品工业科技ScienceandTechnologyofFoodIndustry2003增刊兔小肠吸收纳豆激酶的免疫组织化学定位研究段智变江汉湖赵小燕(南京农业大学食品科技学院南京210095)LocalizationoftheNattokinaseintheSmallIntestineofRabbitbyImmunohistochemicalAnalysisDUANZhibianJlANGHanhuZHA0Xiaoyan(CollegeofFoodScienceandTechnology，NanjingAgricUnivNanjing，China，210095)Abstract：Object
2、iveTostudythesmallintestinalabsorptionmechanismofNattokinase(NK)takenorallyviaimmunohistochemicalsRabbitantiseraagainstNKpurifiedfromNattowatersolubleextractfermentedwithBN10wasobtained9malerabbitsweredividedinto3groups：controlgroup，soybeanwatersolubleextractgroup(takenorally，200mlrabbitday)andNatto
3、watersolubleextractgroup(takenorally，200mlrabbitday)，theexperimentperiodis10weeksForimmunohistochemistry，duodenal，jejunalandilealwerecarefullycollectedandfixedinlOneutralbufferedalin，processedroutinely，andembeddedinparaffinI。ocalizationofNKwasinvestigatedusingStreptavidinbiotinperoxidasecomplex(SABC
4、)TheprimaryantibodyisrabbitantiNKserum，thesecondbridgeantibodyisbiotinylatedgoatantirabbitIgGandth(、thirdantibodyisStreptavidinperoxidasecomplexPBSbufferandrabbitnonimmuneIgGwereusedasthenegativecontrolsinplaceoftheprimaryantibodyResultsHistologicexaminationindicatedthatNattoandsoybeanwatersolubleex
5、tractdonteffectthemorphaofthegastrointestinaltractImpunohistochemicalstainingindicatedthattheduodenum，jejunalandilealwereallpositiveintheNattOwatersolubleextractgroup，NKwasfoundinthebrushbordermembraneofepithelialcellfromtheduodenumtotheileal，andtheyshowedmostpredominantintheduodenumAllthesegmentsof
6、controlgroup，soybeanwatersolubleextractgroupandtheirnegativecontrolswerenotstainedConclutionNattokinasecanbeabsorbedinsmallintestine，theabsordefficiencyinjejunumisbetterthanthatinduodenumandileumKeywords：Nattokinase；ImmunohistochemicalLocalization；Takeorally；Smallintestine纳豆是日本传统发酵食品之一，由枯草杆菌(Bacillu
7、ssubtilis)的一些种或纳豆菌(Bacillusnatto)发酵大豆制成，其中含有能溶解血栓、有纤溶活性的纳豆激酶(Nattokinase，NK)Eli，它不但能直接作用于纤维蛋白，而且能激活体内纤溶酶原，表现出烈强的纤溶活性口“，动物试验研究表明，将纳豆激酶经小鼠十二指肠给药，在血浆中可检测到NK5，经颈动脉血栓模型兔十二指肠给药，凝血时间(Coagulationtime，CT)、凝血酶原时间(Prothrombintime，PT)、凝血酶时间48(Thrombintime，TT)和活化的部分凝血活酶时间(Activiatedpartialthrombopastintime，APTT)
8、均显著延长，优球蛋白溶解时间(Euglobulinlysistime，ELT)和纤维蛋白原(fibrinogen，Fig)含量显著降低，纤维蛋自降解产物(Fibrin(ogen)degradationproducts，FDP)含量明显增高，血浆D一二聚体(DDimer)呈阳性6，因此NK可成为治疗栓塞性疾病的口服药物。本文用免疫组织化学ABC法，对口服摄入纳豆激酶在小肠中的吸收情况进行了研究，为阐明其溶栓机理提供理论食品工业科技ScienceandTechnologyofFoodIndustry2003增刊依据。1材料和方法11材料111纳豆制作工艺大豆一清洗、浸泡一灭菌一接种一发酵一后熟一纳
9、豆，严格控制生产工艺条件，保证产品质量稳定。112纳豆菌种BN10本实验室自行分离、筛选保存的菌种。113大豆为南京农业大学国家大豆品种改良中心提供的菜豆5号品种。114纳豆提取物的制备取本实验室制作的成熟纳豆100g，粉碎后加灭菌水200ml，搅拌，静置过夜，4000rmin离心30min，收集上清液冷冻保存，1ml相当于05g成熟纳豆剂量。115兔抗纳豆激酶抗血清本实验室制备。12试剂121链霉菌抗生物素蛋白(Streptavidin，SP)检测试剂盒美国Zymed公司生产。122抗体稀释液(DILUENT)BioGenexSanRomonCA94583USA生产。1。23胰蛋白酶液(Tr
10、ypsinbuffer)：福州迈新生物技术开发公司生产。124显色剂DAB(DAKO公司)。13实验动物分组及组织取材雄性日本大耳白兔9只(东南大学医学院实验动物中心提供)，许可症号SCxK(苏)20020006，体重(2505)kg。基础颗粒饲料购自江苏省农科院兽医研究所。一随机分为3组，每组3只：正常对照组(给予足量自来水)、口服大豆提取液为特异性对照组(每天每只口服煮熟大豆提取液200ml，饮用完后再给予足量自来水)、口服纳豆激酶粗制液为实验组(每天每只口服纳豆激酶粗制液200ml，饮用完后再给予足量自来水)，饲养条件完全相同，实验期10周。以250A硫贲妥钠25mgkg耳缘静脉注射麻醉
11、，将其仰卧位固定于兔板上，沿腹中线打开腹49腔，取十二指肠前段510cm、取前段空肠10cm以下小肠1015cm、取回盲瓣前段回肠10cm以前小肠1520cm，分别作为十二指肠、空肠、回肠的组织样品采样段，分别作两端结扎，向其中缓慢注入lo中性福尔马林溶液，各截取2cm，分别浸泡于相同福尔马林溶液中固定3天，行常规石蜡包埋，蜡块连续切片，分别作免疫组化和HE染色，后者作常规病理检查。14免疫组织化学染色按文献记载的方法78和试剂盒说明书进行染色。具体步骤简述如下：1415肚m组织切片用二甲苯行石蜡切片常规脱蜡。142分别用无水乙醇、95、80、70乙醇行石蜡切片常规脱水。143滴加3H。O。(
12、蒸馏水新鲜配制)，室温，10min，阻断内源性过氧化物酶活性。144PBS缓冲液冲洗，5min3。145用胰酶进行抗原修复，8min。146PBS缓冲液冲洗，5rain3。147滴加5正常山羊血清(PBS稀释)封闭非特异性抗原，室温，10min，弃去多余液体，不洗。148滴加兔抗纳豆激酶抗血清，经预试验选择工作浓度为1：200，4C，过夜。149001molLPBS缓冲液冲洗，5min3。1410滴加生物素(Biotin)标记的山羊抗兔鼠IgG抗体(SPA液)，37C，30min。1411PBS缓冲液冲洗，5min3。1412滴加链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(HRP)(SPB液)，37、C，
13、30min。1413PBS缓冲液冲洗，5min3。1414DAB室温显色，蒸馏水洗。1415苏木素复染，蒸馏水洗。1416脱水，透明，中性树胶封片。各组均设阴性对照和替代对照切片，阴性对照以O01MPBS代替兔抗纳豆激酶抗血清，替代对照以正常兔血清代替兔抗纳豆激酶抗血清，其余处理与实验切片完全相同。结果判断以浅于淡黄色的为阴性(包括淡黄色)，以浅棕色至深棕色为阳性。食品工业科技ScienceandTechnologyofFoodIndustry2003增刊2结果与分析21HE染色光镜下观察HE染色结果表明，各组十二指肠、空肠和回肠各肠段的吸收上皮细胞均呈高的柱状上皮细胞，排列整齐完整，纹状缘完
14、整致密。口服纳豆激酶粗制液组空肠的HE染色结果见图1。22正常对照组与口服大豆水提液组各肠段免疫组化染色结果表明，正常对照组与口服大豆水提液组十二指肠、空肠和回肠各肠段上皮细胞均无浅棕色至深棕色的特异性染色，且各切片的阴性对照及替代对照也如此。口服大豆水提液组空肠免疫组化染色结果见图2，箭头所示无特异性染色。图1口服纳豆激酶粗制液组空肠(HE染色，t00)图2口服大豆水提液组空肠(1：100400)性分布(分别见图3、图5中箭头所示)，空肠纹状缘上深棕色阳性颗粒最多，且在上皮细胞胞浆中可观察到棕色的阳性颗粒(见图4中箭头所示)，而各切片的阴性对照及替代对照均无特异性染色(口服纳豆激酶粗制液组空
15、肠免疫组化染色阴性对照见图6中箭头所示)。图3口服纳豆激酶粗制液组十二指肠(1：100400)图4口服纳豆激酶粗制液组空肠(1：100400)23口服纳豆激酶粗制液组各肠段免疫组化染色结果表明，口服纳豆激酶粗制液组十二指肠、空肠和回肠各肠段上皮细胞均有不同程度的从浅图5口服纳豆激酶粗制液组回肠(1：100400)棕色至深棕色的特异性染色颗粒，其中，十二指肠和回肠的纹状缘上特异性的阳性染色颗粒呈弥漫50食品工业科技ScienceandTechnologyofFoodIndustry2003增刊图6口服纳豆激酶粗制液组空肠(阴性对照400)3讨论31各组十二指肠、空肠和回肠HE染色结果表明各肠段吸
16、收上皮细胞的结构正常，表明口服大豆水提液和纳豆激酶粗制液不影响兔小肠的组织结构，各肠段切片与正常对照组一样没有任何病理损伤。正常对照组与口服大豆水提液组十二指肠、空肠和回肠上皮细胞均无特异性染色，且各自阴性对照及替代对照也无特异性染色，证明组织的阳性结果不是抗体以外的混杂血清成分所致，而是该抗体的特异性阳性结果。32猪十二指肠灌注试验表明，小肽混合物吸收率明显高于相应氨基酸混合物91，且已有研究表明，机体对蛋白质的主要消化产物小肽有独立的小肽转运系统，该系统具有转运速度快、耗能低、不易饱和的特点1“，且转运效率与机体肠道组织中含有的小肽转运蛋白(PepTl)密切相关。目前，已从兔小肠cDNA文库中筛选到一个编码707个氨基酸的小肽转运蛋白(PepTl)，并且已经证明PepTl是吸收蛋白质降解产物一小
