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1、质粒DNA的提取,分子生物学实验,目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作。,2. 相关知识及原理,质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,DNA超螺旋结构,细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一
2、个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,质粒类型：,载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件： 易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选； 易于导入受体细胞。,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, K
3、anamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。,载体的结构：,DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,原理：,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒
4、DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5。 pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一
5、个N端c-Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。,Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains. Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: 500,pCMV-Myc-T10,4. 步骤 质粒DNA的提取 碱裂解法,溶液1GET缓冲液： 5
6、0mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇,注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接
7、种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上
8、清液; 沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,Biodev（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）,碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。,使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按1:3的比例加入无水乙醇。,操作步骤,收集1.53ml菌液沉淀于1.5m
9、l离心管中。加入100l溶液1，振荡至彻底悬浮。 为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12小时； 细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低 加入150l溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管冰上放置12分钟（时间勿超）。,加入150l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟。 要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2和步骤3后，冰上放置。 将420l结合缓冲液加入离心柱中。然后将步骤3的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀。12000rpm离心30秒钟
10、。倒掉废液收集管中得溶液。 加入750l洗涤缓冲液于离心吸附柱中，12000rpm离心1分钟。,浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能被洗脱下来，影响回收效率。 A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空管离心2分钟，尽量除去漂洗液。 洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。,如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入50l洗脱缓冲液，室温放置5分钟后，12000rpm离心1
11、分钟。 洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。,为了充分除尽RNA的污染，可在提取的质粒中加入0.5lRNaseA（10mg/ml）。这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。 若提取的质粒大于10Kb，在加入洗脱缓冲液后，可在70水浴中放置35分钟，以确保质粒DNA的完全洗脱。,B. 凝胶电泳检测DNA的浓度,0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder),1 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：,0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。,
