十 微生物的分类和鉴定

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1、第十一章 微生物的分类和鉴定,Classification and identification,概 论,地球上到底有多少物种至今仍无准确答案，估计有分类记录的各类物种大约有150万，其中微生物超过10万。微生物学工作者要认识、研究和利用微生物或控制有害微生物，必须对它们进行分类（classification）。 微生物分类学（microbial taxonomy）是一门按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（taxon）的科学。它的具体任务有：分类、鉴定（identification）和命名（nomenclature）。,第一节 通用分类单元,一、 分类单元及其等级 分

2、类单元（taxon）是指具体的分类群，如原核生物界（Procaryotae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）等都分别代表一个分类单元。微生物的分类单元一般也分为七个基本的分类等级（rank或category）或分类阶元。由上而下依次是：界、门、纲、目、科、属、种。分类单元的等级（阶元）只是分类单元水平的概括，它并不代表具体的分类单元。,种以上的分类单元,Domain（域） Kingdom（界） Phylum（门） Class（纲） Order（目） Family（科） Genus（属） Species（种）,二、 种的概念,

3、种（species）是生物分类中基本的分类单元和分类等级，指一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 在微生物中，一个种只能用该种内的一个典型菌株（type strain）来作具体标本，故这一典型菌株就是该种的模式种（type species）。 新种：是指权威性的分类、鉴定手册中从未记载过的一种新分离并鉴定过的微生物。,三、 学名,学名是指一个菌种的科学名称，它是按照国际细菌命名法规命名的、国际学术界公认并通用的正式名字。一个种的学名是用拉丁词或拉丁化的词组组成。 （一）双名法 学名=属名（斜体）+种的加词（斜体） +（首次定名人）+现名定名人+定名

4、年份 例：大肠埃希氏菌（大肠杆菌） Escherichia coli (Migula) Castellani et Chalmers 1919,（二）三名法 当某种微生物是一个亚种（subspecies, 简称subsp)或变种(variety, 简称var，是亚种的同义词）时，学名就应该按三名法拼写： 学名=属名（斜体）+种的加词（斜体） +符号subsp或var（正体） +亚种或变种的加词（斜体） 例1：苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（蜡螟苏云金芽孢杆菌） Bacillus thuringiensis (subsp) galleria 例2：酿酒酵母椭圆变种（椭圆酿酒酵母） Saccharomyc

5、es cerevisiae (var) ellipsoideus,(三) 有关学名的其他知识 1 .属名 是一个表示该微生物主要特征的名词或用作名词的 形容词，单数第一个字母应大写。 假单胞菌属：Pseudomons可缩成P.或Ps.。 芽孢杆菌属：Bacillus 可缩写成B. 或 Bac. 2、种名加词 种名加词又称种加词，它代表一个物种的次要特征。 字首一律小写，可由形容词或名词组成。,四、 亚种以下的分类单元,亚种以下的分类单元（infrasubspecific taxa）很多，其提出和使用均不受细菌命名法规的限制。 1.亚种（subspecies,subsp.,ssp.） 2.变种（

6、variety,var.） 3.型（form） 4.类群（group） 5.菌株（strain） 6.小种（race） 7.相（phase） 8.态（state）,亚种是进一步细分种时所用的单元，一般指除某 一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征与模式种 相同的种。 菌株又称品系（在非细胞型的病毒中则称毒株或 株），表示任何由一个独立分离的单细胞（或单 个病毒粒）繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后 代。 模式菌株：是一个种的具体活标本，必须是该菌 种的活培养物，是由一个被指定为命名的模式菌 株传代而来。,第二节 微生物在生物界的地位,(1) 两界系统：1753年，瑞典博物学家林奈，在其名著植物种志中

7、，第一次科学地提出动物界（ Animalia）、植物界（Plantae）两界系统。 （2）三界系统：1866年，德国动物学家E.H.Haeckel 建议在动物界和植物界之外，应加上一个由低等生物组成的第三界：原生生物界，它主要由一些单细胞生物和无核类生物组成。 （3）四界系统：1956年，Copeland提出了生物可分为四界的学说，即：动物界、植物界、原始生物界（原生动物、真菌、部分藻类）和菌界（细菌和蓝细菌）。,一、生物的界级分类学说,（4） 五界系统：1969年，R.H.Whittaker在Science上发表了“生物界级分类的新观点”的著名论文。在吸取前人工作经验的基础上，提出了五界学说

8、。五界系统包括：动物界（ Animalia）、植物界（Plantae）、原生生物界（Protista）（包括原生动物、单细胞藻类、粘菌）、真菌界（Fungi）、原核生物界（Monera）(包括细菌、蓝细菌）。 （5）六界系统：1977年，我国学者提出六界的设想， 即在上述Whittaker五界系统的基础上再加上一个病 毒界。,二、三域学说 1977年，C.R.Woese比较研究了多种生物的16S rRNA或18S rRNA的核苷酸序列，提出了三域学说，“域”是一个比界更高的界级分类单元，三域指的是细菌域、古生菌域和真核生物域。,第三节 各大类微生物的分类系统,分类学的最终目标是要建立起一套比较

9、接近生物系统发育规律的自然分类系统。,一、Bergey 氏原核生物分类系统纲要 伯杰氏鉴定细菌学手册 （Bergey Mamual of SystematicBacteriology）编写者集国际学术界的权威学者，为各国微生物分类学界公认的一本经典佳作。,（1）简介 伯杰氏手册最早成书于1923年，第一版名为伯杰氏鉴定细菌学手册，主要编者为美国学者D. Bergey等人。此后，由其他学者不断修订，已先后出版了11个版本。从1980年起，该手册组织了国际上20多个国家的300多位专家，合作编写了4卷本的新手册，书名改为伯杰氏系统细菌学手册，并于1984年至1989年间分4卷陆续发行。此书是目前国

10、际上最为流行的实用版本。伯杰氏系统细菌学手册的第二版从2000年起分成5卷陆续发行。,（2） 伯杰氏系统细菌学手册纲要 伯杰氏系统细菌学手册分5卷出版，手册把原核生物分为古生菌界和细菌界两界，它们相当于三域学说中的两域。其中古生菌界共包括2门、5组、8纲、11目、17科和63属，共有208个种；而细菌界则包括16门、26组、27纲、62目、163科和814属，共有4727个种。因此，至今所记载过的整个原核生物共有4935种。,二、 真核微生物分类系统真菌字典（Dictionary of Fungi） 据估计，在地球上生存的真核微生物有150万种，而目前已记载的只有7万-9万种，全球每年发现的新

11、种约有1500个。自1729年Michei首次对真核微生物进行分类以来，有代表性的分类系统有10多个。 目前得到学术界广泛采用的是Ainsworth第七版（1983年）的安.贝氏菌物词典（ Ainsworth and Bisbys Dictionary of Fungi), 它把真核微生物分成粘菌门和真菌门，而真菌门又分为5个亚门(鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门）。,Ainsworth等人的菌物分类系统纲要,安.贝氏菌物词典第七版 （1983年）,安.贝氏菌物词典第八版 （1995年）,第四节 微生物的鉴定,菌种鉴定工作是各类微生物学实验室经常遇到的基础性的工作。工

12、作步骤：获得该种微生物的纯种培养物（pure culture）、测定一系列必要的鉴定指标、查找权威性的鉴定手册。 微生物的鉴定方法： （1）细胞的形态和习性水平（经典分类鉴定）； （2）细胞的组分水平（细胞壁、脂类、醌类和光合色 素成分分析）； （3）蛋白质水平； （4） 核酸水平；,经 典 鉴 定 指 标,一、 经典分类鉴定方法,形态,个体：细胞形状、大小、排列、运动性、 特殊构造和染色反应等,群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态。,生理生化反应,营养要求：能源、碳源、氮源、生长因子,酶：产酶种类和反应特性,代谢产物：种类、产量、颜色、显色反应,对药物的敏感性,生态特征：生长温度

13、、与氧、PH、渗透压关系、宿主种类、,生活史、有性生殖情况,血清学反应,对噬菌体敏感性,经典分类鉴定方法举例： 1 形态学鉴定 细胞形态学特征 酵母ZJU-10 在麦芽汁液体培养基中，28C下培养 3天后，镜检，细胞呈卵圆形到圆形，无性繁殖方式为多 边出芽；不形成醭，菌液浑浊，有菌体自凝现象；固体培 养时，菌落呈黄色； 子囊孢子的形成 28C、生孢培养基上培养4天，不形成子囊孢子。 假菌丝的形成和形态 有真菌丝及假菌丝；不发酵。,2生理学特性 发酵糖类 待测酵母ZJU-10对相关糖类的发酵情况如下表所示。, 同化糖类 待测酵母ZJU-10对相关糖类的同化情况表,二、现代分类鉴定方法,（一）通过

14、核酸分析鉴定微生物遗传型 1、 DNA碱基比例 指（G+C）mol%值，简称“GC比”，表示DNA分子中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的摩尔百分比值。,通过（G+C）mol%对微生物进行分类有以下几个特点： 亲缘关系相近的种，两者的GC比也接近，反之， GC 比相近的两个种，它们的亲缘关系则不一定都很接 近。 GC 比差距很大的两种微生物，亲缘关系必然较远。 GC比是建立新分类单元时的可靠指标： GC比相差低 于2%时，没有分类学上的意义；种内各菌株间的差 别在2.5%-4%间；若相差在5%以上时，就可认为属于 不同的种，相差在10%，可认为是不同的属。 测定DNA中GC的方法很多，其中的解链

15、温度法较为常用。 XG+C = (Tm - 69.3)*2.44,2、核酸分子杂交 按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条来源不同的单链核酸进行复性（退火），以构建新的杂合双链核酸的技术，称为核酸杂交。核酸杂交法是测定核酸分子同源程度和不同物种间亲源关系的有效手段。 包括DNA-DNA、 DNA-rRNA和rRNA-rRNA分子间的杂交。 一般认为， DNA-DNA杂交同源性超过60%的菌株可以是同种，同源性超过70%者是同一亚种，而同源性在20%-60%范围内，则属于同一个属。,3、rRNA寡聚核苷酸编目分析 通过分析原核或真核细胞中最稳定的rRNA寡聚核苷 酸序列同源性程度，来确定不同生物

16、间的亲源关系和进 化谱系的方法。 16S或18S rRNA编目分析的基本原理是： 用一种RNA酶水解 rRNA后，可产生一系列寡聚核苷 酸片段，如果两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其所 产生的寡聚核苷酸片段序列也越接近。,“三域学说”提出的科学根据。,为何说16S rRNA或18SrRNA是“分子进化尺”？ 普遍存在于一切细胞内； 生理功能既重要又恒定； 在细胞中的含量较高、易提取； 编码rRNA的基因十分稳定； 序列非常保守； 相对分子质量适中。,4、 微生物全基因组序列的测定 对微生物全基因组进行测序，是当前生命科学领域中掌握某微生物全部遗传信息的最佳途径。从1990年起，在人类基因组计划的推动下，微生物全基因组测序工作进展很快，在2000年的一年中，几乎每个月都有新记录出现。,（二）细胞化学成分用作鉴定指标 细胞壁化学成分：如根据肽聚糖分子中肽尾第三位氨 基酸的种类、肽桥的结构以及与邻近肽尾交联的位置 的不同来划分。 全细胞水解液的糖型：对放线菌进行分类 磷酸类脂成分的分析