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1、生物检测技术 核酸探针,前言,从基因工程技术一开始，就伴随着核酸探针的应用。在许多领域如基因研究、SNP检测、STR检测、肿瘤研究、药理学研究等方面，核酸探针都是一种强有力的工具。为了能更好的应用和发展核酸探针，有必要对核酸探针有一个系统的认识。 核酸探针是以研究和诊断为目的，用来检测特定序列核酸(DNA 或RNA)的DNA或RNA片段，称为核酸探针，作为探针的核酸探针片段可以较短(20 bp)，也可以较(5kb)。 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。,核酸探针的标记物,一.放射性标记 放射性同位素是最早使用、也是目前应
2、用最广泛的探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中，以32P应用最普遍。 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级；缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射性标记的探针。,二.非放射性标记,目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，二者都是半抗原。 生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。 地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，运用原理类似于生物素的检测。
3、地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。,核酸探针检测的原理,核酸探针检测所依据的是核酸分子杂交，其工作原理是碱基配对，即2条碱基互补的DNA链(或2条碱基互补的DNA链和RNA链)在适当条件下可以按碱基配对原则，形成杂交DNA分子。 生物体含有相对稳定的DNA序列，不易受外界环境因素的影响而改变。一般来说同种生物的DNA序列相同，不同种生物体DNA序列不同生物个体都有自己独特的DNA序列。根据中心法则DNA双链的核苷酸分子是通过碱基之间的氢键作用力专一性互补配对而结合在一起的，每个基因的RNA和对应的模板DNA链也可以通过碱基配对而结
4、合在一起。核酸探针就是根据核酸分子之间的互补配对原则设计的一种检测目标DNA序列是否存在的一段核酸序列。,核酸探针的分类及制备方法,根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为RNA探针、人工合成的寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针等几类。 1） RNA探针 RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA：DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同活性的DNA探针所产生信号要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A(胰RNA酶)切比用Sl酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结
5、构分析比用DNA探针效果好。,RNA的探针制备过程是将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段中某一适当部位或插入片段下游的某一部位消化重组质粒，使之成为线性DNA，然后在相应的DNA依赖RNA聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。 2)人工合成的寡核苷酸探针 人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下。由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针，长度一般长约1030bp，甚至可达50 bp。如果已知核酸序列可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针，单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对，可以准确地设计杂
6、交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效；如果不知道核酸序列，可依据其蛋白质产物的氨基酸顺序推导出核酸序列从而合成DNA探针。,3)单链DNA探针和双链DNA探针,用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合成单链cDNA探针。 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合成法。
7、双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温度以下，可使探针保持单链状态。,核酸探针的应用现状,一 食品检测中的应用：核酸探针技术已被用于检验食品中 一些常见的病原菌。 （1）大肠杆菌： 产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是引起人和动物腹泻的主要病原之一。用生物素标记的编码大肠杆菌耐热肠毒素(ST)的DNA 片段作为基因探针，检测了污染食品(包括鲜猪肉、鸡蛋、牛乳)中的产ST 大肠杆菌。 （2）沙门氏菌：沙门氏菌是重要的人畜共患致病菌及食物中毒性细菌之一，广泛地分布于自然界及畜禽体内。由该菌引起的食物中毒
8、占细菌性食物中毒的首位。利用生物素标记的克隆沙门氏菌DNA 片段作为基因探针，检测了临床样品、食品及饲料样品中的沙门氏菌。,二 DNA测序及再测序中的应用,DNA 测序早期采用Maxam 和Gilbert的化学法与Sanger的双脱氧法进行测序。由于这两种测序方法是手工测序，所以它的精确度较低。在以上两种方法的基础上，通过与计算机技术和荧光技术的结合，产生的自动测序仪在很大程度上提高测序的精确度。近几年，由于DNA测序技术的不断发展和测序策略的日益成熟，以及自动测序仪的改进，序列测定速度和准确率大为提高，随之出现了基因芯片的测序，它是利用固定探针的样品，进行分子杂交产生的杂交图谱，而排列出待测
9、样品的序列。 随之就出现了基因芯片杂交测序技术(SBH)和邻位杂交测序技术(GSH)。,基因芯片 原理 原型,三 检测人及生物体基因组中特异性序列,用非放射性核酸探针 地高辛核酸探针可对医学病毒，禽类病毒，植物病毒的进行检测；用重复DNA 片段来检测麻风杆菌；用rRNA探针检测铜绿假单脆菌；用核酸探针检测腺病毒、BK病毒，巨细胞病毒以及恶性病原虫、弓形虫、利氏曼原虫等。 虽然以上核酸探针已经广泛地应用于各类病毒的检测，但在检测技术方面还有一些问题，检测一种菌就需要制备一种探针一次只能检测出一种菌或病毒检测的操步骤复杂，效率低等缺点。而基因芯片可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核
10、酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交的操作复杂，自动化程度低，检测目的分子数量少，效率低的缺陷，使核酸探针的应用更加广阔 。现在基因芯片可以用于检测人类的许多疾病如肿瘤，血友病，地中海贫血病，异常血红蛋白病，苯酮尿病等。,四 临床诊断和司法方面的应用,目前利用核酸探针发展起来的PCR在临床上的应用广泛，。例如：对结核、麻风、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等微生物病原体的检测；对艾滋病、病毒、细胞淋巴瘤病毒的检测；数十种遗传病(如镰刀状细胞贫血、血友病、肌营养不良症、舞蹈症等)都采用PCR诊断；肿瘤的诊断；性别鉴定；DNA指纹鉴定。 诊断芯心技术是DNA杂交技术和PCR扩增技术相
11、结合的分子诊断方法，将成为一项现代化诊断新技术。现在，肝炎病毒检测诊断芯片 、结核杆菌耐的性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。未来人们在体检时，由搭载基因芯片的诊断器机器人，对受检者取血，转瞬间体验结果便可以显示在计算机的屏幕上。,五 核酸探针技术在浮游植物检测中的应用,核酸探针技术在浮游植物检测中的应用的是利用高特异性的寡核苷酸探针直接与细胞内的或从细胞中提取出来的rRNA进行杂交，从而在混合样品中检测到特定物种的存在。 不同物种的基因序列在某些位点会存在一定几率的突变，但是它们本身又具有高度的保守性，其序列的相似程度可以反映出它们在系统发育上的关系，当
12、其全序列或者大部分序列被分析时，就可以得到有关物种在系统发育方面的足够信息并因此知道它们在系统发育上的位置，从而鉴定浮游植物。而利用基于这些信息而设计的寡核苷酸探针即可以直接在环境样品进行原位杂交，或者与细胞裂解物进行三明治夹心杂交，从而检测到特定浮游植物在特定海区的存在与否。,核酸探针的前景,基因芯片在环保方面、食品检测方面的研究报道比较少，这将成为将来的研究方向。从某种意义上我们可以认为：基因结构或种类决定物种，基因功能或表达则决定生命即生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径，同时它的发展也带动了蛋白质芯片、细胞芯片、多肽芯片、组织芯片的发展和应用。 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出其巨大的应用前景。,核酸检测试剂盒图片 通用型核酸检测试剂盒 解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法),谢谢,
