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1、中国协和医科大学 博士学位论文 人源打靶载体介导的人-珠蛋白基因转移研究 姓名：赵娜 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：梁植权;刘德培 20030601 中国协和医科大学博士学位论文 人源打靶载体介导的人A Y 一珠蛋白基因转移研究 摘要 基因治疗是指将遗传物质导入患者体内，使患者获得有益治疗的一种新 型治疗方式，它是根治遗传性疾病的最直接和有效的方法。造血干细胞 ( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l ，H S C ) 因具有自我更新和多谱系分化的能力成为基 因治疗的最理想的靶细胞。基因治疗的基本目标是外源基因整合于H S
2、C 的 染色体。 人类珠蛋白基因家族包括a 一和1 3 一两个基因簇，两簇内各功能基因呈红 系组织特异性、发育阶段特异性、终产物始终维持平衡的表达。一旦平衡失 调将导致地中海贫血。D 地贫的发生是由于人类B 。珠蛋白基因簇中的D N A 序列缺失或突变导致B 珠蛋白肽链合成不足，相对过剩的。一珠蛋白肽链自 身形成四聚体，从而导致红细胞形态及功能异常。 D 一地贫是人类较为常见的造血系统遗传性疾病，目前尚无疗效满意的治疗 方法。6 一地贫的基因治疗大多采用病毒载体介导的造血千细胞的基因转移策 略。尽管病毒载体对遗传信息的传递非常有效，但是由于载体的不稳定性可 导致转移基因不稳定整合和表达，而且病
3、毒载体在转移基因的过程中可能发 生的随机插入突变及可能产生的野生型重组病毒对机体危害甚大，因此寻找 安全有效的载体系统是目前基因治疗领域的重要课题。为避免病毒载体的上 述负面效应，在本研究中，我们引入一种新型打靶载体H C D T v ( h u m a n c l l r o m o s o m e d e r i v e dt a r g e t i n gv e c t o r ) 。H C D T V 是一种人D ，G 组染色体靶向 的人源载体，它利用人类D ，G 组染色体短臂上的序列作为打靶臂，通过同 源重组将外源基因定向导入D ，G 组染色体短臂r D N A 区，r D N A
4、序列可以为 外源基因的表达提供合适的染色质环境，最终获得外源基因的高效表达。 H C D T V 的基本骨架是细菌人工染色体( b a c t e r i a l a r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ， B A C ) 载体，它的两个打靶引导序列( t a r g e t i n gl e a d i n gs e q u e n c e ) T G L S l 和 T G L S 2 分别为1 5 k b 和1 6 k b ，来源于D ，G 组染色体短臂，与其高度同源。 打靶臂之间为正筛选基因N e o 基因，打靶臂以外、T G L S 2 与B A
5、 C 载体骨架 之间为负筛选基因t l ( 基因，N e o 基因上游与T G L S 2 之间的N h e I 位点可允许 外源基因的插入。携带外源基因的打靶载体转染细胞后，经过G 4 1 8 进行正 筛选，G C V 进行负筛选，所获得的细胞克隆即为外源基因定向整合克隆。 许多f 临床病例及实验表明胎儿型血红蛋白( f e t a lh e m o g l o b i n ，H b F ) 的增 中国协和医科大学博十学位论文 加，有利于p - 地贫症状的缓解，这是因为n 与非a 珠蛋白链之间的不平衡降 低。因此提高H b F 的表达，对于B 一珠蛋白基因表达缺陷来讲，是一种较有潜 力的治疗
6、方法。采用基因添加的方法，将一正常人一珠蛋白基因导入B 地贫患者H S C 中，稳定整合后在成熟红细胞中适宜表达，用以纠正珠蛋白 肽链的不平衡状态，这种基因治疗方法有望长期缓解p ，地贫病人的贫血症 状。 B 珠蛋白基因簇的远端调控元件即基因座控制区( 1 0 c u sc o n t r o lr e g i o n L C R ) 由四个红系组织特异、发育阶段稳定的D N a s eI 高敏位点 ( h y p e r s e n s i t i v es i t e ，H S I = H S 4 ) 组成。每个H S 包含一个长度介于2 0 0 ：4 0 0 b p 的核心序列，它分布着
7、红系特异和通用的反式因子的结合基序，是体现H S 功能活性的关键部位。完整的L C R 长2 0 k b ，经人工删节，由L C R 核心序 列及其旁侧序列重组成的微小L C R ( m i n i L C R ) 保持了完整的L C R 的部分 功能活性。在病毒载体介导的人“Y 一珠蛋白基因导入M E L 细胞的研究中， 由H S 3 和H S 2 构成的2 5 k b m i n i L C R 可指导人珠蛋白基因的高效表达， 每个拷贝基因表达的人一珠蛋白基因达到鼠内源性a 珠蛋白的7 5 。 在本研究中，我们以经过删节的4 7 k bm i n i L C R ( H S 4 3 2 )
8、 为增强子， 删除至一1 5 9 位的一珠蛋白基因启动子为启动子，这两种调控元件与l 。9 k b 人珠蛋白基因连接，克隆到人源打靶载体上，大量制备并纯化该重组体 后，转染人红白血病细胞系K 5 6 2 细胞，研究了人珠蛋白基因在细胞内 的整合状态与表达水平。 由于该打靶载体是种一质粒载体，基因转移效率会直接影响以后的基 因治疗效果。为了更方便、直观地观察并检测对人红白血病细胞的基因转染 条件，同时便于富集靶细胞，我们将标记基因一增强型绿色荧光蛋白( e n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n c e p r o t e i n ，E G F P
9、 ) 基因克隆到打靶臂之外t k 基因下游的 B a m H I 位点。经过同源重组以后，E G F P 基因被整合掉，不会影响“y 一基因的 表达， 我们将质粒A V 5 3 H S 4 3 2 中的4 7 k b H S 4 3 2 与质粒p H S 4 0 “Y 中的一珠蛋 白基因共同克隆到打靶载体的打靶臂之间获锝大小为2 28 k b 的E H 7 重组体。 重组体用L F 2 0 0 0 试剂转染K 5 6 2 细胞，4 8 小时后荧光显微镜下观察 瞬时转染效率，并用流式分析仪进行检测，其转染效率为8 9 ，经过G 4 18 进行正筛选，G C V 进行负筛选，挑选4 2 个单克隆，
10、扩增、培养抗G 4 18 及 G C V 的K 5 6 2 细胞建立了相应产珠蛋白基因的细胞系。为了检测细胞 单克隆中外源一珠蛋白基因的整合，分别用E G F P 基因和N e o 基因引物对 基因组D N A 进行扩增，结果全部克隆均为E G F P 基因阴性，N e o 基因阳性， 初步表明细胞克隆中有外源基因的整合。S o u t h e r n 印迹证实所有克隆均完整 中国协和医科大学博士学位论文 整合有外源一珠蛋白基因及其调控序列，并且杂交带型符合定向整合带 型，但是其确切整合位点有待F I S H 结果证实。 我们用R N a s e 保护实验( R N a s ep r o t
11、e c t i o na s s a y , R P A ) 检测珠蛋白基 因在K 5 6 2 细胞中的表达。用H e r o i n 诱导各单克隆细胞分化，4 天后，提取 细胞总R N A ，进行R P A 检测。其中1 5 个未经H e m i n 诱导的克隆的R P A 实验 结果显示：Y 一珠蛋白基因在稳定整合克隆中的表达量较对照细胞明显为高， 其中个克隆的表达量是对照的1 1 4 2 9 倍，其余四个克隆与对照相比无明 显变化，平均表达水平为对照的l ，8 6 倍。对经H e m i n 诱导的7 个克隆进行R P A 实验的结果表明6 个克隆的表达量是对照的1 卜3 2 9 倍，1
12、 个克隆的表达无 法分析，平均表达水平为对照的1 6 7 5 倍：并且随着一珠蛋白基因的整合及 表达增加，a 一和E 一珠蛋白的表达也呈上升趋势，其具体机制有待进一步研究。 综合上述结果表明：( 1 ) 在D N A 水平上，外源一珠蛋白基因及其调控 序列能够稳定存在于入源打靶载体中；( 2 ) 外源基因能完整整合于细胞染 色体上不发生缺失、重排；( 3 ) 打靶载体的打靶臂能指导外源基因经同源 重组后整合于细胞染色体上；( 4 ) 完整整合克隆能高效表达A Y 一珠蛋白基因。 在1 5 个未经H e m i n 诱导的克隆中，有1 1 个克隆的表达量是对照的1 1 4 2 9 倍， 另外四个
13、克隆与对照无明显变化，其平均表达水平为对照的1 8 6 倍 经H e m i n 诱导的7 个克隆中的6 个克隆的一珠蛋白基因表达量是对照的1 卜3 2 9 倍， 平均为1 6 7 5 倍：( 5 ) 随着一珠蛋白基因表达量的增加，o 【一和 珠蛋白的表达 也呈上升趋势。 中国协和医科大学博士学位论文 A b s t r a c t H u m a nC h r o m o s o m e - D e r i v e d T a r g e t i n gV e c t o r - M e d i a t e d H u m a n A 7 G l o b i nG e n e T r a n
14、 s f e rR e s e a r c h G e n et h e r a p yc a l lb ed e f i n e da st h em o d i f i c a t i o no ft h eg e n o m eo fc e l l st o t r e a to r p r e v e n td i s e a s e s I t i st h em o s td i r e c ta n de f f e c t i v em e t h o df o rt h e t r e a t m e n to f h e r e d i t a r yd i s o r d
15、 e r s H e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ( H S C s ) a r er e g a r d e d a s t h em o s ti d e a l t a r g e t c e l l si n g e n et h e r a p y b e c a u s eo ft h e i r c a p a c i t y o f s e l f - r e n e w i n g ( b e i n ga b l et og i v e r i s et o l i t e r a l l yb i l l i o n s o
16、 fp r o g e n yc e l l sf o r e s s e n t i a l l yal i f e t i m e ) a n dp l u r i p o t e n td i f f e r e n t i a t i o n ( b e i n ga b l et og i v er i s et o c e l l so fa l lh e m a t o p o i e t i ca n dl y m p h o i dl i n e a g e s ) I ti sa na t t r a c t i v et r e a t m e n t s t r a t e g yf o rm a n yg e n e t i ca n dh e m a t o l o g i c a ld i s e a s e st ot r a n s f e rt h e r a p e u t i cg e n e s i n t
