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1、1 0 8 4 增强自主创新能力促进吉林经济发展 乳腺癌H E R 一2 n e u 肽疫苗的实验研究 王芳1才子斌2 王毅1徐煌1侯立中1颜炜群1 ( 1 吉林大学再生医学科学研究所；2 吉林大学第一医院长春1 3 0 0 2 1 ) 摘 要：目的：设计并制备显著激活细胞毒性T 细胞( C T L ) , 的高特异性H E R 一2 n e u 肽疫苗，并对其进 行活性实验研究。方法：合成2 种与M H C I 类分子高亲和性的区段P 舵瑚、铷并对其进行修饰。建立 B A L B ，c 小鼠的乳腺癌模型，用上述多肽做疫苗，G M C S F 做佐剂，免疫小鼠，分别应用M T I 法、E L
2、I S P O T 法、颗粒酶释放法测定T 细胞的增殖，T 细胞分泌I F N 一叮，C T L 对肿瘤细胞的杀伤活性。结果：经修饰的 H E R 一2 n e u 多肽疫苗可促进T 细胞增殖，促进T 细胞分泌I F N Y 及C T L 杀伤乳腺癌细胞。结论：经修饰 过的H E R 一2 n e u 多肽疫苗可显著激活细胞免疫，增加对乳腺癌细胞的杀伤作用。 关键词：乳腺癌H E R 一2 n e uM H C I 类分子多肽疫苗 乳腺癌是妇女最常见的一种恶性肿瘤，约2 5 3 0 的乳腺癌患者出现癌基因H E R 一2 n e u ( c e r b B 2 ) 过表达，表达产物结合相应的生
3、长因子，导致细胞的增殖和异常分化。H E R 2 n e u 是恶性肿瘤主动免疫治 疗的理想靶点，因为：H E R 2 ，n e u 是肿瘤病因学中一种肿瘤相关抗原；某些肿瘤病人存在H E R 2 n e u 特异性 抗体或C T L 反应；已证明被动免疫疗法如H E R 2 n e u 特异抗体H e c e p t i n 有抗肿瘤作用。目前的研究证实 从H E R 一2 n e u 蛋白中选取的多肽可激活针对H E R 一2 n e u 的特异性C T L 反应。但是这种反应的局限性是 多肽分子较小，因而多数抗原肽免疫原性较低，在体内半衰期短，容易被酶类降解，导致其诱导的特异性 C T
4、L 存在时间短，效价低。本实验通过对H E R 一2 n e u 肽疫苗进行化学修饰，来探讨增加肽疫苗免疫活性的 方法。 1 材料与方法 1 1 细胞系及实验动物 D 2 F 2 细胞，转染人H E R 一2 n e u 的B A L B c 小鼠乳腺癌细胞系，培养基为含1 0 胎牛血清的D M E M ； B A L B c 小鼠，6 8 周龄，雌性，由吉林大学医学部基础实验动物部提供。 1 2 H E R 一2 n e u 肽疫苗的制备 模拟H E R 一2 n e u 的空间构象，从中选取并合成与M H C I 类分子高亲和的长9 个氨基酸的两个区段 P 蛇一5 0 ( H L Y Q
5、G C Q V V ) 、P 7 8 2 铆S R L L G I C L ) ，并进行氨基端乙酰化，羧基端加一个甘氨酸。同时选取一种不与 M H C 1 分子结合的H E R 一2 n e u 多肽P ，弘，篮( G D P L N N 7 r I P ) 。应用F m o c 法合成肽，C 1 8 柱H P L C 法纯化合 成肽，纯度大于9 8 ，质谱测定合成肽分子量。将纯化的肽溶解在p H 7 4 的P B S 中( 2 m g m 1 ) ，分装前过滤 除菌，于一7 0 。C 保存。 1 3 小鼠乳腺癌模型的建立及免疫【1 1 对照组注射生理盐水0 ：2 m l ；G M C S F
6、 组注射G M C S F 3 0 0 n g 0 2 m l ；5 个多肽+ G M C S F 组小鼠背部多 点免疫肽3 0 1 山g 0 2 m l ，一周后再次免疫，以上每组小鼠在一次免疫后都隔天注射G M C S F ，每只3 0 0 n g 0 2 m l 。 吉林省第四届科学技术学术年会1 0 8 5 1 4T 细胞增殖的测定1 2 第二次免疫后一周，每组随机选取六只小鼠，无菌取脾，调整细胞浓度为2 x 1 0 6 m l ，加入9 6 孔培养板， 每孔1 0 0 1 z l ，实验孔添加合成肽1 0 0 1 z l ，终浓度分别为5 w g m l ，1 0 t z g m l
7、 ，2 0 1 x g m l ，M T r 法测定O D 值。求出 S I 。S I = 实验孔O D 平均值对照孔O D 平均值。 1 5 效应细胞的制备 3 1 第二次免疫后一周，每组随机选取六只小鼠，无菌取脾，调整细胞浓度至2 x 1 0 7 m l ，。取l m l 添加2 4 孑L 培养板，每孑L 添加合成肽2 0 0 t x l ，( 终浓度为1 0 1 x g m 1 ) 和I L 一2 ( 终浓度1 0 U m 1 ) ，3 7 。C ，5 C 0 2 下培养8 天即 成为效应细胞。 1 6 对肿瘤细胞的杀伤活性的测定【4 】 应用细胞毒性T 细胞颗粒酶释放法。颗粒酯酶分泌百
8、分率( ) = 1 0 0 ( D B ) ( R B ) 。 1 7 T 细胞分泌I F N Y 的测定 参看文献5 。 1 8 在体肿瘤生长情况测定 第二次免疫两周后杀鼠，用游标卡尺测定肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，并计算抑瘤率，肿瘤抑 瘤率( ) = 1 一 实验组平均瘤重( T ) 对照组平均瘤重( C ) 。 1 9 统计学处理：数据以X + S 表示。采用方差分析。 1 多士里 二 三口木 2 1合成肽对T 细胞增殖的影响 未修饰的多肽和G M C S F 能促进免疫小鼠T 细胞的增殖但与之相比修饰后的多肽更明显促进T 细 胞的增殖，最佳的浓度是1 0 1 x g m l ( 表
9、1 ) 。 表1合成肽对T 细胞增殖的影响( x + sn = 6 ) S I 组别 s p g m l 多肽1 0 1 x g m l 多肽2 0 斗g n a 多肽 对照组 1 0 2 7 + 0 1 21 0 3 2 + 0 1 81 0 1 2 + 0 1 9 G M C S F 组 1 1 1 2 + 0 2 11 1 2 4 + 0 2 41 1 0 9 + 0 1 8 P 4 撕 1 1 9 2 _ + 0 2 91 3 2 8 _ + 0 2 71 2 8 6 _ + 0 2 6 H A c P 4 搿 。1 4 5 3 _ + 0 2 6 ( 1 ) ( 2 )1 7 6 1
10、 O 3 2 ( 1 ) ( 2 )1 6 2 3 _ + 0 2 4 1 ) ( 2 ) P 7 8 2 删 1 1 7 5 _ + 0 4 21 3 0 9 _ + 0 3 51 2 9 3 + 0 2 7 H A c P 7 渊 1 3 8 9 _ + 0 3 3 ( 1 ) ( 2 )1 7 5 6 + 0 3 5 ( 1 ) ( 2 )1 5 9 7 _ + 0 3 C 1 ) ( 2 ) P 1 弘l 篮 1 1 0 2 _ + 0 3 21 1 2 1 _ + 0 2 51 11 4 _ + 0 2 4 与对照组相比较：P 0 0 1 ；与P I 舡璐组比较：”P 0 0 5 2
11、 2 合成肽对T 细胞分泌I F N 一1 的影响 未修饰的多肽和G M C S F 使T 细胞分泌I F N 一 y 增加，但不明显，而修饰后的多肽能明显地增加T 细 胞分泌I F N 一1 的能力( 表2 ) 。 1 0 8 6增强自主创新能力促进吉林经济发展 表2E L I S P O T 测定分泌I F N 一1 的T 细胞个数( x sn = 6 ) 组别蓝色斑点个数 对照组3 2 0 1 0 1 G M C S F 组7 0 9 2 4 7 P 4 硪 1 8 6 9 3 4 2 H A e P 蝴6 8 4 4 3 7 7 m ( 2 ) 1 5 7 7 2 8 9 H A c
12、P 缸铷 5 7 4 2 4 4 3 1 1 ) ( 2 ) P 1 扯l 篮 1 1 0 8 2 7 6 与对照组相比较：1 P 0 0 5 ：与P 组比较：P O 0 1 2 3 颗粒酶释放法测定C I Z 的活性 修饰后的多肽组都能明显地激活特异细胞毒性T 细胞，使之释放颗粒酯酶增多，增加对D 2 F 2 乳腺癌 细胞杀伤力( 表3 ) 。 表3 合成肽对C T L 杀伤率( ) ( 主sn = 6 ) E ：T 组别 4 0 ：12 0 ：11 0 ：1 对照组 1 4 4 4 811 3 4 27 6 3 1 G M C S F 组2 0 4 7 21 6 3 5 11 2 4 4
13、2 P 4 2 确 2 9 7 3 92 4 8 3 71 6 1 4 7 H A e P 4 硝 4 9 5 5 2 1 ) ( 2 3 6 9 4 3 ( 1 ) ( 2 )2 8 7 3 6 1 ) ( 2 3 1 2 4 32 4 8 3 71 9 5 3 9 H A e 4 5 4 4 3 ( 1 ) ( 2 )3 0 9 4 3 m r 2 )2 4 4 6 7 ( 1 ) ( 2 ) P 胁l 嚣 2 1 2 3 51 7 2 3 51 3 4 3 6 与对照组相比较：( 1 ) P 0 0 1 ；与P m 瑚组比较：P 0 0 5 2 4 合成肽对小鼠D 2 F 2 乳腺癌细胞
14、生长的影响 与天然多肽相比，经修饰后的多肽能明显抑制肿瘤的生长( 表4 ) 。 表4 合成肽对小鼠D 2 F 2 乳腺癌细胞生长的抑制作用( x sn = 4 ) 组别 瘤重( g ) 抑瘤率( ) 对照组 1 5 8 0 0 2 6 G M C S F 组 1 4 8 0 0 3 56 3 P 4 瑙 1 2 5 9 0 1 92 0 3 H A e P 蝴 0 7 9 8 0 4 4 ( 1 ) ( 2 4 9 5 ( 1 ) ( 2 ) 1 3 9 8 0 2 91 8 1 H A e P 7 渊 0 8 9 4 0 3 0 ( 1 ) ( 2 )4 3 4 ( 1 ) ( 2 ) P
15、1 弘1 嚣 1 4 2 6 0 3 5 9 7 与对照组相比较：”P 0 0 1 ；与P 卧璐比较：P O 0 5 吉林省第四届科学技术学术年会1 0 8 7 3 讨论 肿瘤细胞的肿瘤排斥抗原主要是肿瘤相关抗原，H E R 2 n e U 原癌蛋白是其中有代表性的一个。h e r 2 n e u 原癌基因编码与表皮生长因子受体同源的跨膜蛋白，在多种肿瘤细胞表面有H E R 2 n e u 蛋白的过量 表达，特别是乳腺癌和卵巢癌细胞。有研究表明，肿瘤H E R 2 n e u 在胞内的降解多肽片段可以以M H C 限制 性方式活化C T L 细胞，这些活化的C T L 可杀伤表达H E R 2 n e u 的肿瘤细胞。因此，H E R 2 n e u 是肿瘤主动 特异性免疫治疗理想的靶分子。现已证实，合成肽能直接与M H C I 类分子结合，而不需要抗原提呈细胞 ( A P C ) 的加工、处理，与天然的内源性肽再激活免疫系统方面具有同等效力。与肿瘤细胞疫苗、基因工程疫 苗相比，多肽疫苗的优点是可方便地合成所设计的多肽，易于制备和纯化，没有毒性或感染因子的污染： 大大地降低了引起自身
