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1、 博博 士士 学学 位位 论论 文文 基于菌种层面的纯生啤酒泡沫稳定性的研究基于菌种层面的纯生啤酒泡沫稳定性的研究 作者姓名 王 肇 悦 指导教师 何国庆 教 授 学科专业 研究方向 食品科学 食品微生物 所在学院 生物系统工程与食品科学学院 提交日期 二五年五月 中国 浙江杭州 单位代码单位代码 研究生学号研究生学号 论文答辩日期： 答辩委员会主席： 答辩委员会成员： 论 文 评 阅 人： Studies on foam stability of unpasteurized beer based on Saccharomyces cerevisiae A Dissertation Submi
2、tted for Ph.D Degree by Wang Zhao-Yue Supervisor : Prof. Dr. He Guo-Qing College of Biosystem Engineering and Food Sciences Zhejiang University May, 2005 Hangzhou, Zhejiang. China 目目 录录 目录 摘要 Abstract 第一章 文献综述 1 1. 前言 1 2. 影响纯生啤酒泡沫稳定性的因素 1 2.1 啤酒泡沫特性 1 2.2 泡沫化学组成 2 2.3 影响熟啤酒泡沫的主要因素及影响机理 3 2.3.1 影响熟啤
3、酒泡沫的主要因素 3 2.3.2 蛋白质 Z 及 LTP1 对啤酒泡沫的影响机理 3 2.4 影响纯生啤酒泡沫的主要因素酵母蛋白酶 A 4 2.4.1 前蛋白酶 A 原、蛋白酶 A 原及蛋白酶 A 的分子生物学特征 5 2.4.2 酵母蛋白酶 A 的结构与功能 6 2.4.3 酵母蛋白酶 A 的动力学特征 7 2.4.4 啤酒酿造过程中影响蛋白酶 A 活性的因素 8 3. 纯生啤酒泡沫稳定性的改善策略 9 3.1 原料选择与工艺控制 9 3.2 用抑制剂对啤酒进行后修饰 9 3.3 培育富含泡沫阳性蛋白大麦品种 9 3.4 培育酵母蛋白酶 A 缺陷型菌株 9 4. 基因敲除法构建酵母蛋白酶 A
4、 缺陷型菌株 10 4.1 反向遗传学概述 10 4.2 基因敲除的遗传学基础 11 4.3 基因敲除技术的发展及基本步骤 12 4.4 基因敲除技术的应用 16 4.5 前景与展望 16 5. 研究现状 16 6. 本论文研究思路 17 参考文献 17 第二章 酵母蛋白酶 A 测定方法的改进及其在纯生啤酒中的应用 29 1. 前言 29 2. 材料与方法 29 2.1 材料及主要试剂 30 2.2 仪器 30 2.3 实验方法 30 2.3.1 酵母蛋白酶 A 粗提液制备 30 I 2.3.2 底物制备方法 30 2.3.3 酵母蛋白酶 A 酶活性测定方法 31 3. 结果与分析 31 3.
5、1 血红蛋白为底物时酵母蛋白酶 A 活性的测定 31 3.1.1 血红蛋白为底物时酶浓度对蛋白酶 A 活性的影响及不同检测方法 比较 31 3.1.2 血红蛋白为底物时底物浓度对蛋白酶 A 活性的影响及不同检测方 法比较 32 3.2 酪蛋白为底物时酵母蛋白酶 A 活性的测定 32 3.2.1 酪蛋白为底物时酶浓度对蛋白酶 A 活性的影响及不同检测方法比 较 32 3.2.2 酪蛋白为底物时底物浓度对蛋白酶 A 活性的影响及不同检测方法 比较 33 3.3 不同饱和度硫酸铵盐析后酵母提取液中酵母蛋白酶 A 活性的比较 34 3.4 纯生啤酒在不同饱和度条件下盐析后酵母蛋白酶 A 活性的比较 3
6、4 4. 讨论与结论 35 参考文献 36 第三章 啤酒泡沫蛋白的电泳分离及其与酵母蛋白酶 A 的关系 40 1. 前言 40 2. 材料与方法 40 2.1 材料及主要试剂 41 2.2 仪器 41 2.3 实验方法 41 2.3.1 啤酒泡沫的提取 41 2.3.2 啤酒蛋白的电泳分离 42 2.3.3 凝胶染色 42 2.3.4 蛋白含量的测定 42 2.3.5 凝胶图象分析 42 2.3.6 酵母蛋白酶 A 粗提液的制备方法 42 2.3.7 酵母蛋白酶 A 粗提液对啤酒蛋白的水解作用 43 3. 结果与分析 43 3.1 电泳染色方法比较以及电泳条件的确定 43 3.1.1 不同染色
7、方法的对比 43 3.1.2 电泳条件的确立 45 3.2 啤酒泡沫蛋白与酵母蛋白酶 A 关系 45 4. 讨论与小结 47 参考文献 48 第四章 纯生啤酒存放过程中泡沫稳定性与蛋白组成以及蛋白酶 A 的变化 51 1. 前言 51 II 2. 材料与方法 51 2.1 材料及主要试剂 52 2.2 主要仪器 52 2.3 实验方法 52 2.3.1 纯生啤酒中酵母蛋白酶 A 粗提液制备及酶活性测定 52 2.3.2 纯生啤酒存放过程中泡持时间测定 53 2.3.3 纯生啤酒存放过程中蛋白含量的测定 53 2.3.4 不同存放时间纯生啤酒泡沫蛋白的电泳分离 53 3. 结果与分析 53 3.
8、1 纯生啤酒存放过程中酵母蛋白酶 A 的变化及影响因素 53 3.2 纯生啤酒存放过程中泡持性与泡沫变化及影响因素 54 3.3 纯生啤酒存放过程中蛋白含量的变化及影响因素 56 3.4 纯生啤酒存放过程中蛋白组成的变化 57 4. 讨论与小结 57 参考文献 58 第五章 酵母蛋白酶 A 的分离纯化及其对啤酒泡沫蛋白的特异性 62 1. 前言 62 2. 材料与方法 62 2.1 材料及主要试剂 63 2.2 仪器 63 2.3 实验方法 64 2.3.1 蛋白酶 A 粗提液制备 64 2.3.2 蛋白含量的测定 64 2.3.3 酶活性测定方法 64 2.3.4 凝胶层析纯化酵母蛋白酶 A
9、 64 2.3.5 离子交换层析纯化酵母蛋白酶 A 65 2.3.6 纯化酵母蛋白酶 A 的电泳鉴定 65 2.3.7 纯化酵母蛋白酶 A 对啤酒蛋白的水解 65 3. 结果与分析 66 3.1 蛋白酶 A 的分离纯化 66 3.2 纯化后蛋白酶 A 的电泳鉴定 67 3.3 蛋白酶 A 对啤酒蛋白的水解及鉴定 68 4. 讨论与结论 69 参考文献 71 第六章 基因敲除法构建酵母蛋白酶 A 缺陷型菌株 75 1. 前言 75 2. 材料与方法 75 2.1 材料及主要试剂 76 2.1.1 酵母菌株及质粒 76 III 2.1.2 引物 76 2.1.3 培养基 76 2.1.4 工具酶和试剂 76 2.2 仪器
