《酶联免疫吸附试验双抗体夹心法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶联免疫吸附试验双抗体夹心法（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、医学免疫学实验,实验三,（一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法） 2、斑点免疫层析试验 （二）免疫细胞的分离与纯化 1.密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞） （三）免疫细胞功能测定 1、E玫瑰花环试验（示教） 2、淋巴细胞转化试验（示教） （四）结核病相关的免疫试验简介,（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）,待检标本 阳性对照 阴性对照,“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37，30分钟：,（一）免疫标记技术 【概念或原理】： 利用荧光素、酶、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗体或
2、抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或抗体的量或其存在与否。 【分类】 荧光免疫技术 酶免疫技术ELISA（双抗体夹心法 ） 放射免疫技术 金免疫技术斑点免疫层析试验 化学发光免疫技术等,Ag, Ab 荧光素,Ag,Ab荧光素, Ab 荧光素,（？）, Ab荧光素,（洗涤）,免疫标记技术举例：,（细胞表面可见荧光）,6,cells with fluorescence,tubercle bacillus with fluorescence,8,酶免疫技术,酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体 ELISA (酶联免疫吸附试验，enzyme-link
3、ed immunosorbent assay) sandwich ELISA to detect Ag indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ab or Ag,1）已知抗体包被 2）洗板 3）加待检抗原标本 4）洗板 5）加酶标记抗体 6）洗板 7）加底物显色，测定 (measure color),10,（显色） （不显色） （定量）,( no Ag ),( Ag ),polystyrene,Sandwich ELISA (to detect Ag, 双抗体夹心法，原理),（封闭的意义）,（一）免疫标记技术 1、酶联免疫
4、吸附试验 (ELISA) -双抗体夹心法,请按照实验指导讲义方法进行操作，第5-9步； 第5、7步孵育时间由60min改为30min； 结果肉眼判断 第5步按下页PPT的图加样，加6个孔，37，30分钟，（实验课开始时已做，接着做第6步，洗板）,（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）,待检标本 阳性对照 阴性对照,“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37，30分钟：,13,( Indirect ELISA to detect Ab ),14,（一）2、斑点免疫层析试验 (dot gold immunochromatographic ass
5、ay，DICA),the “rapid tests“ that you might use to detect pregnancy, or diagnose an infection quickly in a doctors office.,16,B C T R A,(Nitrocellulose membrane),金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG）,特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素）,固相特异性抗体（抗HCG）,固相抗小鼠IgG抗体,阳性：T区、 R（或C）区均出现红色线条（两条红线）； 阴性：T区不出现红色线条，仅R（或C）区出现红色线条（一条红线）。,17,18,p
6、ositive negative invalid,（一）2、斑点免疫层析试验,请按照实验指导讲义方法进行操作，并判断结果，,（二）免疫细胞的分离与纯化 1. 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）,（二）1. 外周血单个核细胞的分离 密度梯度离心法,原理 1）人外周血中红细胞、粒细胞密度1.092左右，单个核细胞为1.0751.090。根据各类血细胞比重的差异，分离得到单个核细胞。 2）外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，可进一步分离得到淋巴细胞。,离心前 离心后,抗凝血,分离液,血浆层,单个核细胞层,分离液,红细胞、粒细胞,（白色云雾状，薄层）,Main method:,Ant
7、icoagulated blood are layered on the top of Ficoll (lymphocyte separation medium), horizontal centrifugation, Four layers: plasma, lymphocytes, Ficoll, granulocytes and red blood cells;(figure) Collect lymphocytes.,23,方法,1. 每桌（4人，2组）准备抗凝血1份（约4ml）；（已做，用前混匀） 2. 将分层液（淋巴细胞分离液）加入试管（已做） 3. 每组用吸管吸取肝素抗凝血约2m
8、l缓慢加在淋巴细胞分离液之上（沿试管壁缓慢加入）； 4. 水平离心(2000rpm, 20 min)；,方法,5. 将吸管轻插至淋巴细胞层，沿试管壁周缘轻轻吸取上下液界面间的单个核细胞层，置另一干净试管内； 6. 洗涤单个核细胞2次(加入约1ml Hanks 液, 混匀，离心，1500或2000rpm，5min，倒去上清；重复1次)； 7. 用残留上清(或加Hanks 液约0.1ml)重悬获得的单个核细胞，备用； 8. 吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片上，显微镜下观察单个核细胞（以淋巴细胞为主）,Lymphocytes (淋巴细胞),Lymphocytes, cancer cells? 淋
9、巴细胞（淋巴癌？）,normal small lymphocyte in blood smear (血片中淋巴细胞),lymphocyte,small lymphocytes (cancer cells) in non-Hodgkins lymphoma 小淋巴细胞（非霍奇金小淋巴细胞淋巴瘤）,（三）免疫细胞功能测定 1、E花环试验 原理： T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体）(CD2)，若T细胞与绵羊红细胞共同孵育，T细胞周围吸附绵羊红细胞，为花环形成细胞， 可用来鉴定和计数T细胞,T细胞 SRBC 花环形成细胞,B细胞 SRBC,（6080）,CD2,E 花环形成率=,形成E花环细胞数,形
10、成E花环细胞 + 未形成花环淋巴细胞,100%,(6080%),E 花环形成率=,形成E花环细胞数,形成E花环细胞数 + 未形成花环细胞数,100%,总E花形成率：6080% 活性E花形成率：2540%,rosette forming cell,T cell,rosette forming cell,rosette forming cells,rosette forming cell (electron microscope),显微镜下观察花环形成细胞，310室，不要求计算E花环形成率。,（三）2、淋巴细胞转化试验,PHA T淋巴细胞 （小细胞） 淋巴母细胞,T cell lymphoblas
11、t (small cell) (large cell) B cell resting B cell (small cell),(Untransformed lymphocytes),(transformed lymphocytes) (转化的淋巴细胞),(未转化的淋巴细胞),PHA,PHA,转化率 =,转化的淋巴细胞数,转化的淋巴细胞数 + 未转化的淋巴细胞数,100%,T cells,T cells + B cells,100%,（6080%）,核分裂相细胞,过渡型细胞,转化的淋巴细胞包括以下三种细胞： （1）淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的34倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈细网状
12、。核内见明显核仁14。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。 （2）过渡型淋巴细胞：具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。体积比小淋巴细胞大。 （3）核分裂相细胞：核呈有丝分裂，可见 许多对成堆或散在的染色体。,Lymphoblast ( typical, morphological features): Lymphoblasts are 12-20 m in diameter with a round to oval nucleus, sometimes eccentric in location. The nucleus to cytopla
13、sm ratio is about 4:1 and the periphery of both the nucleus and the cell may be irregular in outline. The fine, highly dispersed nuclear chromatin stains a light reddish-purple, and one or two pale blue or colorless large nucleoli are visible. The cytoplasm is usually agranular and deeply to moderat
14、ely basophilic, with marginal (peripheral) intensity a common characteristic. (Small resting lymphocytes are 6-8 m in diameter),46,Small lymphocytes transformed lymphocytes (lymphoblasts, large cells),mitosis metaphase,(Ag,or mitogen),stimulation, untransformed lymphocyte, small transitional cell typical lymphoblast,untransformed lymphocyte,Lymphoblast, (transformed lymphocyte),Acute lymphocytic leukemia,Lymphoblast, 原始淋巴细胞,Lymphoblast, 原始淋巴细胞,核仁,图1 狗外周血中的淋巴母细胞,图2（大图）、狗急性淋巴细胞性白血病血片，可见大量淋
