现代生物技术细胞工程

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1、1,细胞工程的基本原理,1,植物细胞工程,2,细胞工程,2,第一节 细胞工程的基本原理,一、细胞工程的内容 （1）定义 应用细胞生物学的方法，在体外条件下以细胞为基本单位进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁殖动、植物个体，或获得某种有用的物质的过程。,3,一、细胞工程的内容,根据其研究对象不同，分为植物细胞工程、动物细胞工程和微生物细胞工程。 细胞是细胞工程操作的主要对象。 原核细胞 细菌、放线菌 真核细胞 酵母菌、动物细胞、植物细胞,4,细胞工程,植物细胞工程,动物细胞工程,植 物 组 织 培 养,植 物 体 细 胞 杂

2、交,动 物 细 胞 培 养,动 物 细 胞 融 合,单 克 隆 抗 体,胚 胎 移 植,核 移 植,微生物细胞工程,微 生 物 细 胞 培 养,微 生 物 细 胞 杂 交,5,二、发展史,18381839年提出细胞学说； 1902年提出细胞全能性； 细胞全能性：植物细胞具有原植物的全部遗传性，单细胞经人工培养，通过细胞分裂而恢复成完整植株。 1904年用胡萝卜胚培养成株，三十年代获愈伤组织。 1948年发现腺嘌呤，生长素对芽形成的影响，建立腺嘌呤/生长素的比例控制芽根分化。,6,二、发展史,1956年发现激动素促芽形成效果高，促组培工作研 究； 六十年代从曼陀萝花药培养获植株建花培技术； 19

3、72年细胞融合成功； 1912年培养动物细胞； 1958年获细胞融合（种间、腹水癌细胞+病毒） 六十年代初换核术成功； 1975年获杂交瘤； 我国70年代中开始细胞融合； 现有40多种花粉植株，在我国首次成功。,7,三、细胞工程的基本操作,无菌操作技术 细胞培养技术 细胞融合技术,8,1、无菌操作技术,细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下进行，实验操作成在无菌室内进行。无菌室应定期用紫外线或化学试剂消毒，实验前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做好准备后方可进入无菌室，操作时实验者的双手应戴无菌手套。 注意周围环境的卫生整洁。 生物材料、一切器械、器皿和药品应

4、进行灭菌或除菌。,9,无菌操作,杀菌和消毒 物理法 化学试剂 抗生素 超净工作台,10,2、细胞培养技术,细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要求等方面有许多差异，但作为细胞培养，它们也有些共同之处。 首先，要取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒。有时还需要某些特定的酶对材料进行顶处理，以期得到分散生长的细胞。 其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基并进行灭菌。将生物材料接种于培养基中，最后将接种后的培养基放入培养室或培养箱中培养。当细胞达到一定生物量时应及时收

5、获或传代。,11,12,3、细胞融合技术,两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。 细胞融合是细胞工程的重要基本技术，其主要过程包括：制备原生质体。由于微生物及植物细胞具坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将细胞壁降解。动物细胞则无此障碍。诱导细胞融合。两亲本细胞(原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度；按1：1的比例混合后，用物理、化学或生物的方法促进融合。筛选杂合细胞。将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细胞无法生长。以获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。,13,细胞融合技术 制备原生质体 诱导细胞融合 化学法

6、 物理法 生物法 筛选杂合细胞,14,四、细胞培养技术,1、微生物细胞培养 2、植物细胞培养 3、动物细胞培养,15,1、微生物细胞培养,1）培养基的组成 碳源 氮源 无机盐 维生素 水,16,1）培养基的组成,碳源 蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；由其他谷物、马铃薯、红薯、木薯等得到的糖类物质。 作用：维持培养基的合适渗透压； 构造微生物体； 参与新陈代谢。 注意:不同浓度影响细胞的增殖分化。,17,1）培养基的组成,氮源 来源：无机氮源（氨气、铵盐或硝酸盐等）和有机氮源（氨基酸、蛋白质或尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等）。 作用：构成微生物细胞、蛋白质和

7、核酸的主要元 素。 细胞生长分化需氮。,18,1）培养基的组成,无机盐 大量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以上。 微量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以下。 大量元素：P、K、Mg、S、Ca等； 微量元素：钴、铜、铁、锰、钼、锌等。 作用：构成菌体的组成； 作为酶活性基团的组成部分； 调节微生物体内的pH值。,19,1）培养基的组成,维生素 维生素是生物体生长不可缺少的一种或数种极微量的有机物质，但微生物在生长时，自身往往又缺乏合成这种有机物的能力，因此，必须由外界提供。与微生物关系较大的维生素，主要是B族维生素。 作用：是微生物体内各种酶活性基团的组成部分。 直接参与生物催化剂酶的形成及蛋白质

8、、脂肪的代谢。,20,1）培养基的组成,维生素C（抗坏血酸）：强还原能力，防组 织氧化变褐。 B1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤 组织活力有关。 B2（烟酸或维生素PP）：促代谢，促胚的 发育，高浓度会抑制生长。 B6（吡哆醇）：促根生长。 肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用， 但有助活性物质发挥作用。,21,1）培养基的组成,水 培养基大部分是水 来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水）或去离子水。 目的：保持培养基成分完全人为控制。 作用：起媒介作用 组成作物体（占7580%） 提供O、H元素 运输物质、调节渗透压,22,2）培养基的种类,按成分不同划分： 天然培养基：含有化学成分还

9、不清楚或化学成分不 恒定的天然有机物。 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。 根据物理状态分： 固体培养基 半固体培养基 液体培养基,23,2）培养基的种类,按用途划分： 基础培养基 加富培养基（营养培养基） 鉴别培养基 选择培养基 其他培养基：分析培养基、还原性培养基等,24,3）培养方法,（1）固体培养； （2）液体培养； （3）连续培养； （4）中间补料培养； （5）同步培养； （6）混合培养。,25,2、植物细胞培养,广义的植物细胞培养是指在无菌条件下，将离体的单个游离细胞在人工控制的环境里培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。 食品工

10、业意义上的植物细胞培养主要是指细胞悬浮培养，即使游离的植物细胞或一些小的细胞团在液体培养基中增殖并分离提取细胞产生的代谢产物。,26,2、植物细胞培养,植物细胞体系建立的一般程序为：整体植株株植物组织或器官外植体在固体培养基上诱发愈伤组织愈伤组织继代培养悬浮培养。,27,2、植物细胞培养,基本操作过程： 一般利用次亚氯酸盐的稀溶液、酒精、升汞等消毒剂对合适的植物材料进行表面消毒灭菌，在无面条件下切取未受损伤或未被污染的组织或器官(即外植体)，置于固体培养基上培养，随着细胞增殖形成不定型细胞团(即愈伤组织)，将此愈伤组织移入新鲜固体培养基中继代培养或转入液体培养基中悬浮培养。愈伤化时间随植物种类

11、和培养基条件不同而不同，慢的需要几周以上，一旦增殖开始，就可反复继代培养，加速细胞生殖。继代培养可用试管或烧瓶等，大规模悬浮培养可用传统的搅拌罐、气式发酵罐。,28,2、植物细胞培养,植物细胞培养与动物细胞培养相比，具最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。 其培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。包括植物生长所必需的16种营养元素和某些生理活性物质。,29,2、植物细胞培养,植物细胞培养方法 单细胞培养、原生质体培养； 固体培养、液体培养（摇瓶悬浮培养和大规模悬浮培养）。 悬浮培养是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。

12、,30,2、植物细胞培养,植物细胞培养方法 1）植物细胞悬浮培养法 分批培养法 半连续培养法 连续培养法,31,2、植物细胞培养,植物细胞培养方法 2）植物细胞固定化培养技术 所谓固定化细胞培养，即把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维或膜上面或里面，细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应其营养。,32,常用的细胞固定化培养系统,平床培养系统,立柱培养系统,33,3、动物细胞培养,动物细胞培养是指离散的动物活细胞体外人工无菌条件下的生长增殖，在整个过程中细胞不出现分化，不再形成组织。 根据细胞是否贴附于支持物上生长的特性，培养的细胞可分为两大类：悬浮型和贴附型。 悬浮

13、型细胞是指生长时呈悬浮状态的细胞；贴附型是指贴附于支持物上生长的细胞。 动物细胞培养的一般程序是：组织切碎-酶处理得单个细胞-培养-再扩大培养。,34,3、动物细胞培养,1）细胞培养基的组成 氨基酸 维生素 盐：钠、钾、镁、钙、氯等金属离子和酸根离子 葡萄糖 有机添加剂 激素和生长因素,35,3、动物细胞培养,2）常用培养基 天然培养基 合成培养基 无血清培养基,36,3、动物细胞培养,3）动物细胞培养方法 悬浮培养 贴壁培养 固定化培养 大规模培养法,37,五、细胞融合技术,细胞融合技术是指在一定条件下，将两个或多个细胞融合在一个细胞的过程，细胞融合又称细胞杂交。,38,五、细胞融合技术,1

14、.细胞融合的方法 生物学法 化学融合剂法 电处理融合法,39,五、细胞融合技术,2.微生物原生质体的制备与融合 1）微生物原生质体的制备 为制备微生物的原生质体，必须有效地去除细胞壁，根据各种微生物细胞壁的不同结构和组成，可以用不同的方法来脱壁。目前，常用酶法来脱壁。,40,41,五、细胞融合技术,2.微生物原生质体的制备与融合 1）微生物原生质体的制备 原生质体制备之前，微生物细胞需经过种子培养、振荡培养到一定的对数生长期，其菌量约为菌悬浮液中4l08个mL时为宜，然后加溶菌酶在42轻轻振荡45min即形成原生质体，由于原生质体对渗透压敏感，因此在琼脂培养基上涂布培养，原生质体会在低渗条件下

15、破裂失活，不能形成菌落，曲落越少说明原生质体化效果愈好。 原生质体形成率原生质休数/未经酶处理的总菌数。,42,五、细胞融合技术,2.微生物原生质体的制备与融合 2）微生物原生质体融合和再生 融合是把两亲本的原生质体混合在一起，采用不同的方法进行，最常用的是PEG 融合和电融合。 融合率融合子/两亲本原生质体再生菌落的总数,43,五、细胞融合技术,3.植物原生质体的制备 1）取材与除菌 2）酶解 3）分离 4）洗涤 5）鉴定,44,五、细胞融合技术,4.融合子的筛选 1）微生物融合子的筛选 2）植物融合子的鉴定 3）动物细胞融合子的鉴定,45,第二节 植物细胞工程,植物细胞工程：以植物细胞为基

16、本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操作，使细胞的一些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良品种或生产生物产品的目的的一种技术。,46,植物细胞工程,47,细胞的全能性：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。,48,脱分化：已分化（或成熟）的组织又恢复到无分化的初始状态。 在组织培养过程中，将已经分化的茎、叶、花等外植体进行培养，使其形成愈伤组织，回复到没有分化的状态。 再分化：在组织培养过程中，对处于脱分化状态的愈伤组织进行培养，诱导其形成新的植物体的过程。,49,外植体：在植物组织培养过程中，从植物体上被分离下来接种到培养基上，供培养用的原生质体、细胞、组织、器官等。 建立外植体的过程： 从植