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1、第十二章：动物细胞培养技术,第一节 体外培养动物细胞的生物学特征 第二节 动物细胞体外培养技术 第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定 第四节 细胞同步化 第五节 器官培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长，发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培养有很多优越性，但也有不足之处。 动物细胞培养已广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，细胞生物学，毒理学和临床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经生产出了多种生物制品，如狂犬病疫苗，干扰素，生长调节素。,第一节体外培养动物细胞的生物学特征,一、体外培养物
2、的细胞生物学特点 （一）生物学特征的两重性 1、基本生物学特征与体内细胞相似 体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互关系， 而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相互关系 2、差异性 细胞离体后，失去神经和体液调节以及细胞间的相互影响，在体外培养条件下可能会出现分化现象减弱，形态功能单一化，生存一定时间后衰退死亡，出现连续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本机构和功能，也有不同于体内细胞的性状。,（二）培养细胞分化状态的改变,1、分化 在个体发育的过程中，细胞后代的形态和功能上发生稳定性差异过程称为细胞分化。细胞经体
3、外培养后，其原有的功能可能会迅速改变或消失，但其分化能力并未完全丧失。细胞是否分化，关键是在于是否存在使细胞分化的条件，把表皮细胞放在企业界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的胶质细胞，但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧失。 2、去分化 去分化也叫脱分化是指各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能个性，表现出某种趋同性的过程。,二、体外培养细胞的形态,当细胞初一较好的培养条件时，形态上有相对的一致性。在一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别，故可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素的影响而发生改变。 （一）贴附型细胞和悬浮型细胞 1、贴附型细胞（见下图） 1） 成纤维细胞型
4、2 ）上皮细胞型 3 ）游走细胞型 4 ）多形细胞型 2、悬浮性细胞,悬浮性细胞,（二）细胞帖壁过程,对于贴壁型细胞，在液体环境中生长时，基本呈圆形，当附于支持物表面后，开始仍为圆形，但很快会发生形态上的改变，转变为圆饼形即放射延展细胞。在1/2至2小时后，过渡为极性细胞，可呈纺锤形，三角形或不规则多角形等各种形态。 支持物能影响贴附，底物表面不洁不利于贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附，一些特殊物质如LETS，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。,（三）接触抑制和密度抑制,细胞在体外培养过程中，细胞数量不断增多，生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于
5、细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制 当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。,三、培养细胞的增殖能力,体内细胞生长处于动态平衡环境中，而体外培养细胞的生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养是有限的。当增殖到一定密度时，则需分离出一部分细胞并跟新营养液，否则将会影响细胞的继续生存，这一过程称传代 （一）培养细胞生命期、 培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。正常细胞在体外培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生存全过程中，基本经历以下三个阶段。,1、原代
6、培养基 原代培养基也称初代培养基，即从动物机体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃，可见细胞活跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。 2、传代期 初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长，细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复传代。一般，传代十至五十次左右，细胞增殖逐渐减慢，甚至停止，进入衰退期。 3、衰退期 衰退期的细胞虽然能存活，但增殖很慢并逐渐停止，进而发生衰退死亡,传代细胞由于目
7、中因素的影响，可能发生自发转化，其标志是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获得永久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。转化细胞除了比正常细胞能分裂更多的代数之外，还具有不受细胞密度的影响，不具有接触抑制现象和细胞形状不规则，出现异常染色体的特性。转化后的细胞也可能具有恶性性质。 （二）培养细胞“一代”生存期 体外培养的细胞当生长达到一定密度后，都需要做传代处理。 所谓细胞“一代”是指从细胞接种到分离在培养时的一段时间。它与细胞世代和倍增不同，在细胞一代中，细胞能倍增三至六次。每一代的细胞群体都会经历以下四个阶段：1、潜伏期 2、对数生长
8、期 3、稳定期 4、衰亡期,1、潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中悬浮状态的悬浮期，此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于第五表面上的过程，称为贴壁，悬浮期结束。 细胞贴附于支持物后，要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处于潜伏期可有运动行为，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期和细胞密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代细胞培养细胞潜伏期长，24至96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624h；细胞接种密度大时潜伏期短。 2、对数生长期：当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对数生长期。这是细胞增长最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量可
9、作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数MI表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 MI=（分裂相个数/1000个细胞）100% 3、稳定期 细胞数量达饱和密度后，细胞逐渐停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养逐渐耗尽，代谢产物积累，ph降低。此时需做分离培养培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至从底物脱落死亡，故传代应越早越好。 4、衰亡期 一个达到稳定生长期的细胞群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率则逐渐上升，以致细胞死亡数逐渐超过新生细胞数，群体中活细胞数下
10、降。,（二）原代培养与传代培养,1、原代培养 原代培养即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。由于原代细胞离体时间短，其原有的生物学特征仍然保持。一般在原代培养时期合适于作药物测试，细胞分化等方面的研究。 （1）组织块培养法 1）薄层培养法 2）翻转干涸法,1、取材修剪冲洗 2、剪切成1mm3 小块 3、移入培养瓶 4、分布组织小块间距5mm 5翻转培养瓶并加培养液37*c静止12h 6、翻正培养瓶进行培养 7、原代细胞培养,（2）分散细胞培养法,1）机械分散法 采用一些纤维成分很少的组织进行培养时，可以直接用分散法进行分散。可将组织直接用剪刀剪切，
11、用吸管吸打，这种对组织损伤较大，一般可用注射器针心挤压通过不锈钢网的方法。 2）消化分散法 使用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞的方法。消化培养法可以将细胞间质包括基质、纤维等去除，是的细胞分散，形成悬液，适用于大量组织的分离。常用的消化液有胰蛋白酶，胶原酶。另外，链酶蛋白酶，黏蛋白酶，蜗牛酶等也可以用于细胞的分化。 胶原酶是从细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于分离纤维性组织，上皮组织和癌组织，Ga Mg 和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，作用温和，无须机械振动。其常用量为200iu/ml,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖
12、蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。,2、传代培养,当细胞持续生长增殖一段时间到达一定的细胞密度后，就应当将细胞分离到新的培养器皿并补充新的培养培养液进行培养，即为细胞的传代培养。在首次培养应注意以下几点：1细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代，2原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见，传代时不同的细胞有不同的传代时间，因而要根据需要注意观察并及时进行处理，3首次传代时细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新的环境而李宇细胞生存和增殖。 贴壁细胞的传代大都采用酶消化法来进行。部分贴壁生长的细胞可用直接吹打或离心分离后传代。悬浮细胞可直接传代。,（
13、1）贴壁细胞的消化法传代 （2）悬浮细胞的传代,（三）细胞纯化,1、自然纯化 自然纯化是利用某一细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。 2、人工纯化 （1）酶消化法： 1）先用0，5%胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞，然后再换新的混合液继续消化，之后在导致的显微镜下观察并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。 2）吧消化液吸入离心管中，离心去上清，然后移入另一培养瓶中，加培养液置温箱中培养，再向原瓶中也不加新的培养液继续培养。经过几次反复处理，可把成纤维细胞除净。 （2）机械刮除法 1)标记 镜下观
14、察，在培养皿背面圈下上皮细胞生长部位 2)刮除 弃培养基，把无菌刀深入瓶中，肉眼或显微镜下刮除无标记空间 3)冲洗 用hanks液冲洗1或2次，洗出被挂掉的细胞 4）培养 然后注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞存留，可重刮除 （3）反复贴壁法 操作方法与贴壁细胞传代基本相同 （4）克隆法 （5）流式细胞仪技术 （6）其他纯化方法,（四）细胞的冻存复苏及运输,1、细胞冷冻保存 （1）细胞超低温保存的原理 细胞在-70*c以下时，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键在于通过-200*c阶段的处理过程。在此温度范围内，易造成细胞的严重损伤。如果不加保护直
15、接冷冻，细胞内水分结晶，导致胞内电解质浓度增高，ph改变，部分蛋白质变性，溶酶体膜受损而导致溶解酶释放破坏细胞结构，从而造成细胞死亡。因此，为了减少细胞内的冰晶形成，一般在培养液中加入保护剂以减少冰晶形成和细胞死亡。 根据冷冻保护剂是否透过细胞膜可将其分为：1渗透性保护剂2非渗透性保护剂 最常用的保护剂为dmso本身对细菌有毒性作用，可自身灭菌。 （2）细胞冷冻过程 将对数期细胞以等体积20%DMSO培养液重悬，并分装于冷冻管或安培平中，封口，然后降温至4*c30min，冰盒10min，液氮罐气相2h，最后投入液氮中保存。 2、冻存细胞的复苏 （1）离心法 1）取出冷冻管，迅速投入3740*c
16、水浴中，振荡，使之融化。 2）吸入到10ml的培养液中，混悬，离心洗涤1或2次 3）取上清加培养液，调浓度为1*1052*105个/ml （2）直接铺板法 取贮存细胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生长培养集中，进行活细胞计数，密度3*105个/ml 培养1224小时，更换新鲜的完全生长培养基，以去除冷冻剂。,3.细胞运输 1冷冻储存运输2充液法 1）选生长良好的细胞，待接近或刚连接成片时去掉培养液，充新培养液，液量达到瓶颈部，拧紧螺帽，保留微量空气； 2）妥善包转运送，瓶口用胶带密封，并用棉花等做防震防压处理。 3）到目的地后，倒出大部分培养液，仅保留维持细胞生长所需液量，置于37*c培养，次日传代,二、动物细胞培养的基本方法,（一）悬滴培养法 （二）培养瓶培养法 （三）培养板培养法 （四）旋转管 培养法 （五）灌注小室培养法 （六）克隆培养法,六、单细胞分离培养技术主要分为三种，即多孔塑料板克隆细胞法、琼脂培养法和饲养细胞层克隆法,1、多孔塑料板克隆细胞法 首先将细胞悬液混合均匀，在
