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1、第十二章:动物细胞培养技术,第一节 体外培养动物细胞的生物学特征 第二节 动物细胞体外培养技术 第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定 第四节 细胞同步化 第五节 器官培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养,并观察细胞的生长,发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培养有很多优越性,但也有不足之处。 动物细胞培养已广泛应用于病毒学,免疫学,遗传学,肿瘤学,细胞生物学,毒理学和临床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经生产出了多种生物制品,如狂犬病疫苗,干扰素,生长调节素。,第一节体外培养动物细胞的生物学特征,一、体外培养物
2、的细胞生物学特点 (一)生物学特征的两重性 1、基本生物学特征与体内细胞相似 体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互关系, 而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相互关系 2、差异性 细胞离体后,失去神经和体液调节以及细胞间的相互影响,在体外培养条件下可能会出现分化现象减弱,形态功能单一化,生存一定时间后衰退死亡,出现连续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本机构和功能,也有不同于体内细胞的性状。,(二)培养细胞分化状态的改变,1、分化 在个体发育的过程中,细胞后代的形态和功能上发生稳定性差异过程称为细胞分化。细胞经体
3、外培养后,其原有的功能可能会迅速改变或消失,但其分化能力并未完全丧失。细胞是否分化,关键是在于是否存在使细胞分化的条件,把表皮细胞放在企业界面上培养,可分化成含大量角蛋白丝的胶质细胞,但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧失。 2、去分化 去分化也叫脱分化是指各种分化细胞,逐渐失去各自的形态与功能个性,表现出某种趋同性的过程。,二、体外培养细胞的形态,当细胞初一较好的培养条件时,形态上有相对的一致性。在一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别,故可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素的影响而发生改变。 (一)贴附型细胞和悬浮型细胞 1、贴附型细胞(见下图) 1) 成纤维细胞型
4、2 )上皮细胞型 3 )游走细胞型 4 )多形细胞型 2、悬浮性细胞,悬浮性细胞,(二)细胞帖壁过程,对于贴壁型细胞,在液体环境中生长时,基本呈圆形,当附于支持物表面后,开始仍为圆形,但很快会发生形态上的改变,转变为圆饼形即放射延展细胞。在1/2至2小时后,过渡为极性细胞,可呈纺锤形,三角形或不规则多角形等各种形态。 支持物能影响贴附,底物表面不洁不利于贴附,底物表面带有阳性电荷利于贴附,一些特殊物质如LETS,细胞表面蛋白等也参与贴附过程。,(三)接触抑制和密度抑制,细胞在体外培养过程中,细胞数量不断增多,生长空间渐趋减少,最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后,如果培养的是正常细胞,由于
5、细胞的相互接触能抑制细胞的运动,这种现象称接触抑制 当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制,导致细胞分裂停止。,三、培养细胞的增殖能力,体内细胞生长处于动态平衡环境中,而体外培养细胞的生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养是有限的。当增殖到一定密度时,则需分离出一部分细胞并跟新营养液,否则将会影响细胞的继续生存,这一过程称传代 (一)培养细胞生命期、 培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。正常细胞在体外培养时,不论细胞的种类和供体的年龄如何,在细胞生存全过程中,基本经历以下三个阶段。,1、原代
6、培养基 原代培养基也称初代培养基,即从动物机体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃,可见细胞活跃,可见细胞分裂,但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性状相似,更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。 2、传代期 初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长,细胞增殖旺盛,能维持二倍体核型,呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复传代。一般,传代十至五十次左右,细胞增殖逐渐减慢,甚至停止,进入衰退期。 3、衰退期 衰退期的细胞虽然能存活,但增殖很慢并逐渐停止,进而发生衰退死亡,传代细胞由于目
7、中因素的影响,可能发生自发转化,其标志是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性,即细胞获得永久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系。细胞获不死性后,核型大多变成异倍体。转化细胞除了比正常细胞能分裂更多的代数之外,还具有不受细胞密度的影响,不具有接触抑制现象和细胞形状不规则,出现异常染色体的特性。转化后的细胞也可能具有恶性性质。 (二)培养细胞“一代”生存期 体外培养的细胞当生长达到一定密度后,都需要做传代处理。 所谓细胞“一代”是指从细胞接种到分离在培养时的一段时间。它与细胞世代和倍增不同,在细胞一代中,细胞能倍增三至六次。每一代的细胞群体都会经历以下四个阶段:1、潜伏期 2、对数生长
8、期 3、稳定期 4、衰亡期,1、潜伏期:细胞接种培养后,先经过一个在培养液中悬浮状态的悬浮期,此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于第五表面上的过程,称为贴壁,悬浮期结束。 细胞贴附于支持物后,要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处于潜伏期可有运动行为,基本无增殖,少见分裂相。细胞潜伏期和细胞密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代细胞培养细胞潜伏期长,24至96h或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅624h;细胞接种密度大时潜伏期短。 2、对数生长期:当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入对数生长期。这是细胞增长最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量可
9、作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数MI表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 MI=(分裂相个数/1000个细胞)100% 3、稳定期 细胞数量达饱和密度后,细胞逐渐停止增殖,进入停滞期。此时细胞数量不再增加,故也称平顶期。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液中营养逐渐耗尽,代谢产物积累,ph降低。此时需做分离培养培养即传代,否则细胞会中毒,发生形态改变,甚至从底物脱落死亡,故传代应越早越好。 4、衰亡期 一个达到稳定生长期的细胞群体,由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺,群体中细胞死亡率则逐渐上升,以致细胞死亡数逐渐超过新生细胞数,群体中活细胞数下
10、降。,(二)原代培养与传代培养,1、原代培养 原代培养即第一次培养,是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养,中途不分割培养物的培养过程。由于原代细胞离体时间短,其原有的生物学特征仍然保持。一般在原代培养时期合适于作药物测试,细胞分化等方面的研究。 (1)组织块培养法 1)薄层培养法 2)翻转干涸法,1、取材修剪冲洗 2、剪切成1mm3 小块 3、移入培养瓶 4、分布组织小块间距5mm 5翻转培养瓶并加培养液37*c静止12h 6、翻正培养瓶进行培养 7、原代细胞培养,(2)分散细胞培养法,1)机械分散法 采用一些纤维成分很少的组织进行培养时,可以直接用分散法进行分散。可将组织直接用剪刀剪切,
11、用吸管吸打,这种对组织损伤较大,一般可用注射器针心挤压通过不锈钢网的方法。 2)消化分散法 使用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞的方法。消化培养法可以将细胞间质包括基质、纤维等去除,是的细胞分散,形成悬液,适用于大量组织的分离。常用的消化液有胰蛋白酶,胶原酶。另外,链酶蛋白酶,黏蛋白酶,蜗牛酶等也可以用于细胞的分化。 胶原酶是从细菌中提取的酶,对胶原和细胞间质有较强的消化作用,适用于分离纤维性组织,上皮组织和癌组织,Ga Mg 和血清成分不会影响胶原酶的消化作用,作用温和,无须机械振动。其常用量为200iu/ml,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,除去细胞间粘蛋白及糖
12、蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。,2、传代培养,当细胞持续生长增殖一段时间到达一定的细胞密度后,就应当将细胞分离到新的培养器皿并补充新的培养培养液进行培养,即为细胞的传代培养。在首次培养应注意以下几点:1细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前,不要急于传代,2原代培养时细胞多为混杂生长,上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见,传代时不同的细胞有不同的传代时间,因而要根据需要注意观察并及时进行处理,3首次传代时细胞接种数量要多些,使细胞尽快适应新的环境而李宇细胞生存和增殖。 贴壁细胞的传代大都采用酶消化法来进行。部分贴壁生长的细胞可用直接吹打或离心分离后传代。悬浮细胞可直接传代。,(
13、1)贴壁细胞的消化法传代 (2)悬浮细胞的传代,(三)细胞纯化,1、自然纯化 自然纯化是利用某一细胞的增殖优势,而排挤其他细胞生长,最后留下生长优势细胞,去除其他细胞,达到细胞纯化的目的。 2、人工纯化 (1)酶消化法: 1)先用0,5%胰蛋白酶和0,02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞,然后再换新的混合液继续消化,之后在导致的显微镜下观察并不时摇动培养瓶,等到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化。 2)吧消化液吸入离心管中,离心去上清,然后移入另一培养瓶中,加培养液置温箱中培养,再向原瓶中也不加新的培养液继续培养。经过几次反复处理,可把成纤维细胞除净。 (2)机械刮除法 1)标记 镜下观
14、察,在培养皿背面圈下上皮细胞生长部位 2)刮除 弃培养基,把无菌刀深入瓶中,肉眼或显微镜下刮除无标记空间 3)冲洗 用hanks液冲洗1或2次,洗出被挂掉的细胞 4)培养 然后注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞存留,可重刮除 (3)反复贴壁法 操作方法与贴壁细胞传代基本相同 (4)克隆法 (5)流式细胞仪技术 (6)其他纯化方法,(四)细胞的冻存复苏及运输,1、细胞冷冻保存 (1)细胞超低温保存的原理 细胞在-70*c以下时,细胞内的酶活性降低,代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键在于通过-200*c阶段的处理过程。在此温度范围内,易造成细胞的严重损伤。如果不加保护直
15、接冷冻,细胞内水分结晶,导致胞内电解质浓度增高,ph改变,部分蛋白质变性,溶酶体膜受损而导致溶解酶释放破坏细胞结构,从而造成细胞死亡。因此,为了减少细胞内的冰晶形成,一般在培养液中加入保护剂以减少冰晶形成和细胞死亡。 根据冷冻保护剂是否透过细胞膜可将其分为:1渗透性保护剂2非渗透性保护剂 最常用的保护剂为dmso本身对细菌有毒性作用,可自身灭菌。 (2)细胞冷冻过程 将对数期细胞以等体积20%DMSO培养液重悬,并分装于冷冻管或安培平中,封口,然后降温至4*c30min,冰盒10min,液氮罐气相2h,最后投入液氮中保存。 2、冻存细胞的复苏 (1)离心法 1)取出冷冻管,迅速投入3740*c
16、水浴中,振荡,使之融化。 2)吸入到10ml的培养液中,混悬,离心洗涤1或2次 3)取上清加培养液,调浓度为1*1052*105个/ml (2)直接铺板法 取贮存细胞,37*c水浴中快速融化,移入完全生长培养集中,进行活细胞计数,密度3*105个/ml 培养1224小时,更换新鲜的完全生长培养基,以去除冷冻剂。,3.细胞运输 1冷冻储存运输2充液法 1)选生长良好的细胞,待接近或刚连接成片时去掉培养液,充新培养液,液量达到瓶颈部,拧紧螺帽,保留微量空气; 2)妥善包转运送,瓶口用胶带密封,并用棉花等做防震防压处理。 3)到目的地后,倒出大部分培养液,仅保留维持细胞生长所需液量,置于37*c培养,次日传代,二、动物细胞培养的基本方法,(一)悬滴培养法 (二)培养瓶培养法 (三)培养板培养法 (四)旋转管 培养法 (五)灌注小室培养法 (六)克隆培养法,六、单细胞分离培养技术主要分为三种,即多孔塑料板克隆细胞法、琼脂培养法和饲养细胞层克隆法,1、多孔塑料板克隆细胞法 首先将细胞悬液混合均匀,在