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1、中南大学 博士学位论文 去甲斑蝥素对尿蛋白和肾间质纤维化的影响及其机制研究 姓名：叶琨 申请学位级别：博士 专业：内科学（肾脏病学） 指导教师：刘伏友 20070401 博士学位论文 中文摘要 中文摘要 蛋白尿不仅是肾脏疾病的主要临床表现，其本身也作为独立的致 病因子直接参与肾脏病理损害过程，导致肾功能进行性减退。研究表 明，尿蛋白含量可作为反映各种原发性肾脏疾病疗效的评价指标和预 后指标。如何有效降低尿蛋白，延缓肾脏病进展一直是肾病学界普遍 关注的焦点之一。目前临床上对蛋白尿的治疗以糖皮质激素和免疫抑 制剂为主，但两者都存在副作用大，疗效欠佳的弊端。 斑蝥素( c a n t h a r i
2、 d i n ) 是从鞘翅目芫菁科昆虫斑蝥中提取的一种 活性成分，在癌症治疗方面具有独特疗效。但因其毒性较大，临床应 用受到限制。去甲斑蝥素( n o r c a n t h a r i d i n ，N C T D ) 是斑蝥素的重要衍 生物，具有毒性低，药理作用更明确的优点。现已证实去甲斑蝥素可 抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡。目前发现去甲斑蝥素诱导细 胞凋亡的信号转导途径与c a S p a S e 家族和B c l 2 家族密切相关，同时 细胞外信号调节蛋白激酶( E R K ) 、c J I u l N 一末端激酶( J N K ) 和 s u r v i v i n 蛋白也参与
3、了此过程。另一方面，去甲斑蝥素可下调核因子 出( 1 师1 ) 及S m a d 3 的表达，调节基质金属蛋白酶( M M P s ) 及其抑 制因子( T I M P s ) 的比值，从而抑制肿瘤细胞的浸润粘附及局部新生 血管的形成，维持细胞外基质的合成与降解平衡。此外，去甲斑蝥素 还具有抗炎，调节免疫的作用，用于治疗风湿痛、银屑病等免疫性疾 病也有特效。最近还有研究发现，斑蝥素呈剂量依赖性抑制成纤维细 胞株( N I H 3 T 3 细胞) 增殖，对防治器官组织纤维化也有一定作用。 博士学位论文中文摘要 原发性肾小球疾病是一种免疫性疾病，蛋白尿与肾组织炎症、纤 维化及相关基因的表达密切相关
4、。结合上述斑蝥素的药理作用特点可 见，用斑蝥素治疗肾脏疾病具有理论依据。因此，本研究选用去甲斑 蝥素( N C T D ) 干预蛋白超负荷肾病大鼠，旨在观察其对模型大鼠蛋 白尿及肾问质纤维化的影响，并从体内和体外实验探讨其作用机制。 本论文分为四部分：第一部分为N C T D 干预蛋白超负荷肾病大 鼠，观察N C T D 对模型大鼠蛋白尿及肾间质纤维化的影响。第二部 分应用R T - P C R 、免疫组化及W e s t e r nb l o t 的方法，检测N C T D 对蛋 白超负荷。肾病大鼠结缔组织生长因子( C T G F ) 基因和蛋白表达水平 的影响。第三部分观察N C T D
5、 对蛋白超负荷肾病大鼠核因子r B ( N F 1 出) 表达水平的影响。第四部分观察N C T D 对白蛋f l 束, J 激近端 肾小管上皮细胞( H K 2 ) 增殖及上调纤维连接蛋白( F N ) 表达的影 响。 目的：建立蛋白超负荷肾病大鼠模型，观察N C T D 对肾病大鼠 蛋白尿及肾脏间质纤维化的影响，并通过检测肾组织中C T G F 和 N F r _ B p 6 5 的基因和蛋白表达水平( 体内实验) ，及观察N C T D 对白 蛋白刺激H K 一2 增殖及上调F N 表达的影响( 体外实验) ，初步探讨 N C T D 对肾间质纤维化的影响及机制，为N C T D 用于肾
6、脏病的治疗 提供实验依据。 方法：l 、所有S D 大鼠均行单侧肾切除术。实验组大鼠予以腹 腔注射牛血清白蛋白( B S A ) ，建立蛋白超负荷肾病模型后随机分为 模型组( B S A 组，腹腔注射B S A5 9 ( k g m ) 、N C T D 组( 腹腔注射 博士学位论文中文摘要 B S A5 9 ( k g d ) 和N C T D0 1 m g ( k g d ) ) 和甲基强的松龙组( M P 组， 腹腔注射B S A5 9 ( k g d ) 和M Pl m g ( k g d ) ) ；对照组( S a l i n e 组) 仅 注射等量生理盐水。第9 周末处死大鼠。检测
7、血常规及生化指标，各 时相尿蛋白定量；肾组织行光镜、免疫荧光及电镜检查。 2 、实验分组及处理同方法1 。免疫组织化学法及W e s t e r nb l o t 法 对肾组织C T G F 的表达进行定位及半定量分析；R T - P C R 法检测肾组 织中C T G Fm R N A 的表达水平。 3 、实验分组及处理同方法1 。免疫组织化学法对肾组织N F r , B p 6 5 的表达进行定位及半定量分析；R T - P C R 法检测肾组织N F r , B p 6 5 m R N A 的表达水平。 4 、通过细胞毒性实验筛选出对H K - 2 细胞无明显损伤的N C T D 适合浓
8、度。将H K 2 细胞随机分为5 组：对照组( 1 6 4 0 培基组) ，白 蛋白组( 1 6 4 0 + 白蛋白5 9 L ) ，各浓度N C T D 组( 1 6 4 0 + 白蛋白5 9 L + N C T D0 5 ，1 ，2 5 m g L ) 。在各组H I ( 一2 细胞中加入相应干预液孵 育2 4 h 后，采用细胞增殖法( M T T 法) 检测N C T D 对白蛋白刺激H K - 2 细胞增殖的影响；酶联免疫吸附试验( E L I s A ) 测定各组细胞上清中 F N 的蛋白含量；R T - P C R 法半定量分析H K 2 细胞中F Nm R N A 的表 达。 结
9、果：1 、( 1 ) 各组血常规及谷丙转氨酶( _ 蝴) 比较，差异均无 统计学意义( P 0 0 5 ) 。B S A 组与其余3 组比较，球蛋白( G l o ) 升高， 肌酐清除率( C c r ) 、白蛋白球蛋白( A G ) 降低( P O 0 5 ) 。表1 - 2 所示，与B S A 组比较，N C T D 组和M P 组G l o 降低( 2 O 0 5 ) 。 B S A 组C R P 明显高于S a l i n e 组( P O 0 5 ) 。随着B S A 注射时间的延 长，尿蛋白逐渐升高，第5 周末M P 组与B S A 组尿蛋白比较，差异无统计学意义 ( 胗0 0 5
10、 ) ，而N C T D 组较B S A 组显著下降( K O 0 1 ) 。第9 周末，仅有B S A 组 尿蛋白仍明显高于S a l i n e 组( 2 0 0 1 ) ，N C T D 组和M P 组尿蛋白较B S A 组均降 低( p O 0 5 ) 。见表卜3 ，图1 - 2 。 表1 3 大鼠24 h 尿蛋白定量结果( 工s ) T a b l e1 3R e s u l t so fp r o t e i n u r i aq u a n t i t a t i o n 户 0 0 1c o m p a r e dw i t hS ali n eg r o u p ；。， 0
11、0 5c o m p a r e dw it hB S Ag r o u p O 8 6 4 2 0 博士学位论文第一章 “? 1 w5 w9 w 图1 2 24 h 尿蛋白定量比较 F i g 1 2C o m p a r i s o no fp r o t e i n u r i aq u a n t i t a t i o n s + 户 0 0 1c o m p a r e dw i t hS a li n eg r o u p ；A p 0 0 5c o m p a r e dw i t hB S Ag r o u p 4 肾脏病理结果 4 1 肉眼观察 大体观B S A 组肾脏明显
12、肿大、苍白，部分有灰白色结晶；N C T D 组和l J P 组肾 脏稍肿大，色淡。S a l i n e 组、B S A 组、N C T D 组及M P 组的肾重体重( m g g ) 分 别为：( 3 8 3 + _ 0 4 9 ) ，( 7 6 5 1 1 6 ) ，( 6 1 9 + _ 0 9 2 ) ，( 5 8 7 O 3 9 ) 。统计分析显 示，与S a l i n e 组比较，B S A 组、N C T D 组和M P 组。肾重体重均升高( P O 0 1 ) ； 而N C T D 组及肝组肾重体重均低于B S A 组( K 0 0 1 ) 。见图1 3 。 + ：广 一
13、圉 j r j j | | | | jj | | j | | | | | | j i| | | | | | | | | | | | | | j | | | | j 0 0 0 | | j | | | | j 0 | | j | | 0 | | j | | | | | | | | | | 博士学位论文第一章 4 2 光镜检查 P A S M - t k s o n 染色后可见，B S A 组少数肾小球球性硬化及节段性硬化，球囊 粘连，细胞纤维性新月体和微血栓形成，部分系膜基质中重度增生，呈分叶状， 系膜区嗜复红物沉积明显。肾小囊内有血浆蛋白渗出；肾小管扩张。可见大量蛋 白管型，肾小管上皮细胞空泡
14、变性及颗粒变性，部分刷状缘脱落小管灶状萎缩 和纤维化：间质淋巴、单核细胞浸润明显，伴有灶状纤维化。N C T D 组肾小球系 膜基质轻中度增生，系膜区有嗜复红物沉积；肾小管上皮细胞空泡变性及颗粒 变性，部分脱落入管腔；肾问质未见明显病变。船组肾小球系膜基质轻中度 增生，系膜区有嗜复红物沉积；肾小管小灶状萎缩和纤维化，间质中可见淋巴， 单核细胞浸润，及少量纤维化。S a l i n e 组肾脏病理基本正常。见图l - 4 。病理半 定量分析显示，N C T D 组肾小球硬化指数( G S 指数) 和肾小管闻质损伤病理积分 ( T I L 积分) 均显著低于B S A 组( ， o 0 5 ) ，
15、而肝组6 s 指数及T I L 积分与I k S A 组相比，差异无统计学意义( 伶0 0 5 ) 。见表1 - - 4 ，图卜5 图卜 大置肾脏光镜改变( P A S M - M a s s o n 染色x1 0 0 ) F i g 卜4P a t h o l o g i c u lc h a n g e so ft i d n e yb y i c r D p h o t 0 5 r a p 畸P A S l 4 - M a s s o n3 t a l nx 1 0 0 ) ( ) S a l i n eg r o u p 1 l oo b v i o u sp a t b o l o
16、g i c a lc h a n g eW U $ S c C ai ng l o n e r u l i t u b u l ea n d 博士学位论文第一章 i n t e r s t i t i u 皿 ( B ) B S Ag r o u p F o c a la t r o p h ya n df i b r e s isw e r es e e ni nt u b a l ea n di n t e r s t i t i u n ，w i t h g e n e r o u si n f l a m m a t o r yc e l l s ( C ) N C T Dg r o u p B u s hb o r d e r sf e l lo f fi np a r to ft u b u l a re p i t h e l i a le e l l
