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1、实验十 细胞内DNA和RNA的显示【 目的要求 】1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。【 实验原理 】核酸是酸性的,它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。利用这两种染料的混合液处理细胞,可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色,这种颜色上的差异由DNA和RNA聚合程度的不同所引起,因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷,它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力,可使DNA分子染成蓝绿色;而派洛宁分子中仅一个正电荷,可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。【 器材与试剂 】1、器材:光学显微镜、剪刀、镊子、解剖针
2、、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。2、材料:洋葱、蟾蜍。3、试剂:0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿派洛宁混合染液。4、试剂的配制(1)2mol/L醋酸缓冲溶液:用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中,混匀。再称取醋酸钠(NaAC3H2O)2.7g溶于100ml蒸馏水中,使用时按2:3的比例混合两液即成。(2)2%甲基绿染液:称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫,它们必须预先除去,其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中,放在分液漏斗中加入足量的氯仿(三氯甲烷)用力
3、振荡,然后静置,弃去含甲基紫的氯仿,再加入氯仿重复数次,直至氯仿中无甲基紫为止,最后放入40C温箱中干燥后备用。(3)1%派洛宁染液:称取1g派洛宁(吡罗红)溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。(4)甲基绿派洛宁混合染液:将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5:2的比例混合均匀即可。该液应现配现用,不宜久置。【 内容与方法 】一、血涂片DNA和RNA的显示1、制备蟾蜍血涂片:将蟾蜍用乙醚麻醉后,打开胸腔,剪开心包,小心地在心脏剪开一小口,取心脏血一小滴在干净的载玻片一端,用另一载玻片的一端紧贴血滴,待血液沿其边缘展开后,以30400角向玻片的另一端推去,制成较薄的血涂片,室温下晾干。2、
4、固定:将晾干的血涂片浸入95%乙醇中固定510分钟,取出后在室温下晾干。3、染色:将血涂片平放在染色架上,往血标本上加数滴甲基绿派洛宁混合液,染色515分钟。4、冲洗:用蒸馏水冲洗标本片,并用吸水纸吸去玻片上多余的水分,但不要吸得过干。5、分化:将血涂片在纯丙酮中迅速地过一下,进行分化,取出晾干。6、观察:光镜下可见细胞质呈现红色,细胞核呈绿色。二、洋葱表皮细胞DNA和RNA的显示。1、用小镊子撕取一小块洋葱鳞茎表皮置于载玻片上。2、用吸管吸取甲基绿派洛宁染液滴一滴在表皮上,处理3040分钟。3、吸一滴蒸馏水冲洗表皮,并立即用吸水纸吸干(因派洛宁易脱色)。图10-1 显示细胞内DNA(绿色)、RNA(红色)(高倍镜)4、盖上盖玻片后置显微镜下观察。可见细胞核除核仁外均被染成蓝绿色,表明其含有DNA;而细胞质因含有较多RNA故被染成红色。【 作业与思考 】1、简述DNA和RNA的染色原理。2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色?为什么?