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1、Interaction between MYC2 and ETHYLENE INSENSITIVE3 Modulates Antagonism between Jasmonate and Ethylene Signaling in Arabidopsis,贾明珠,background,茉莉酸(jasmonic acid, JA)存在于高等植物体内的内源生长调节物质。茉莉酸类(JAs)与抵抗病原侵染有关.都是植物对外界伤害(机械、食草动物、昆虫伤害)和病原菌侵染做出反应,而诱导抗性基因表达的信号分子，JAs介导的信号传递途径与植物抗性密切相关。 乙烯能促进土中生长的幼苗会形成顶端弯钩(apica
2、l hook),保护子叶和顶端分生组织在出土时免受机械损伤,对顶端弯钩形成机制的研究有助于提高植物成功出土的概率,保证幼苗正常生长,进而提高作物产量。,2012年的工作揭示了赤霉素与乙烯协同调控顶端弯钩的形成机制( An et al., 2012. Cell Research ) ,发现了HLS1是乙烯信号通路核心转录因子EIN3/EIL1的直接靶基因，为解释多种激素调节顶端弯钩形成的机制奠定了基础。 本项工作揭示了另一种植物激素茉莉素拮抗乙烯在顶端弯钩形成中的作用机理，发现因此高剂量的茉莉素处理最终导致植物幼苗中EIN3/EIL1功能显著下降，从而使得HLS1基因无法表达，表达为顶端弯钩的缺
3、失。 同时本文还着重研究了茉莉酸与乙烯在调节植物抗病性应答基因、食草性应答基因、防御昆虫等方面之间的相互作用。,CTR1 EIN2 EIN3 乙烯应答反应 下胚轴生长 顶钩弯曲形成 根的生长 开花 果实成熟 叶片衰老 耐寒性 抵抗病原菌感染,乙烯信号转导途径中基因作用顺序,植物未受到茉莉酸激素刺激时,JAZ蛋白和MYC2蛋白结合在一起,抑制MYC2的表达； 植物受到茉莉酸类激素刺激时,茉莉酸类激素做为信号分子激活SCFCOI1蛋白复合体,JAZ蛋白与SCFCOI1 蛋白复合体结合从而使得MYC2蛋白被释放,游离的MYC2蛋白能与茉莉酸类响应基因DNA结合,从而调控相应的生理过程,完成茉莉酸激素
4、刺激响应;同时JAZ蛋白则被26S蛋白酶体识别而降解。,JA and ET signaling synergy in the regulation of root hair development and resistance against necrotrophic fungal infection. JA represses apical hook formation and positively regulates plant defense against insect attack, while ET functions oppositely.,The molecular mecha
5、nism for such antagonism between JA and ET signaling remains unclear ？,转录因子EIN3/EIL1是乙烯与茉莉素的信号交叉节点, EIN3/EIL1被茉莉素信号通路中的负调控因子JAZ蛋白家族直接抑制,Results 1,MYC2, MYC3, and MYC4 Function Redundantly to Mediate JA-Inhibited Apical Hook Curvature,人们常使用 “三重反应”(triple response)作为判断 乙烯反应强弱程度的形态学标准:外源乙烯引起黑暗中生 的黄化苗出现
6、明显的形态学变化, 包括根和下胚轴伸长受 制、下胚轴横向生长加粗、顶端子叶弯曲生长加剧 ethylene overproducer1 eto1-1 乙烯过量生成突变体 constitutive ET responses (ctr1-1)乙烯信号组成型活化突变体 deficient in ET signaling (ein2-1 and ein3-1 eil1-3)施加外源乙烯时，乙烯不敏感突变体 coi1-1 mutant 失去对JA的调控能力的突变体,JA represses HLS1 expression to inhibit ET-enhanced hook formation and
7、imply that JA acts upstream of HLS1 to repress hook curvature.,To genetically verify whether JA acts upstream of HLS1 ?,The key components responsible for repression of hook curvature in JA signaling pathway ?,JA和ET信号途径在顶端弯钩的形成上的拮抗作用 茉莉素激活其通路中重要转录因子MYC2，而激活后的MYC2通过2种机制来抑制EIN3/EIL1的功能：一是诱导一个F-box蛋白（E
8、BF1）的基因表达，从而加速EIN3/EIL1的泛素化降解；二是直接与EIN3/EIL1蛋白互作，抑制其转录活性。,Resule 2: MYC2 , MYC3, and MYC4 Interact with EIN3 and EIL1,实验方法1： 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 该方法利用黄色荧光蛋白(YFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发
9、出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。,MYC2, MYC3, and MYC4 interact with EIN3 and EIL1,实验方法2,Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具.Pull-Down实验是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法.可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用.至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用
10、来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物)。,MYC2 interacts with EIN3,实验方法3,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prore
11、inA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。,Flag-EIN3 was indeed coimmunoprecipitated with myc-MYC2 ,but not with the control protein myc-COI1,Resule 3: MYC2 Inhibits Transcriptional Activity of EIN3 and EIL1,EIN3 could bind to the promoter of HLS1 to activate its expression, lead
12、ing to hook curvature whether MYC2 affects the influence of EIN3 on HLS1 transcription whether MYC2 could repress the effects of EIN3 and EIL1 on the transcription of another target gene,Results 4,Disruption of EIN3 and EIL1 Suppresses Exaggerated Apical Hook Formation and Resistance against a Necro
13、trophic Pathogen in myc2,MYC2, MYC3, and MYC4 interact with and attenuate EIN3 and EIL1 to repress hook curvature,MYC2 interacts with and attenuates EIN3 and EIL1 to repress resistance against the necrotrophic pathogen B. cinerea.,Results 5,EIN3 and EIL1 Attenuate the Transcriptional Activation Func
14、tion of MYC2 to Repress Plant Defense against Insect Attack,EIN3 and EIL1 attenuate the transcriptional activation function of MYC2,DISCUSSION,1.Molecular, biochemical, and genetic evidence suggest an antagonistic regulatory model in which interaction between MYC2 and EIN3 and EIL1, modulates the JA
15、-ET signaling antagonism .,2.Future research should focus on identifying protein domains essential for the interaction between MYC2 and EIN3 and clarifying whether reciprocal repression between MYC2 and EIN3 occurs on promoters of its target genes or disrupts the binding of MYC2 or EIN3 to its respe
16、ctive target promoters 3.JA and ET exhibit opposite effects on many other plant responses.,补充,瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，为整合进入受体细胞基因组而立即转录出现基因产物，快速研究基因表达、蛋白质亚细胞定位、基因间互作。 LUC基因：荧光酶基因，该酶在有ATP、Mg离子、氧气和荧光素存在下发出荧光。,SDS-PAGE and Immunoblot analysis (Western Blot),Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用
