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1、第 13章 液相色谱法Liquid Chromatography第一节 概述第二节 柱色谱法第三节 薄层色谱法第四节 纸色谱法第一节 概述1、 1906年由俄国植物学家 Tsweet创立植物色素的分离一、 色谱法 (chromatography)2、现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析固定相 除了固体，还可以是液体流动相 液体或气体色谱柱 各种材质和尺寸被分离组分 不再仅局限于有色物质动画二、色谱法分类（一）按两相分子的聚集状态分流动相 固定相 类型液体 固体 液 -固色谱液体 液体 液 -液色谱气体 固体 气 -固色谱气体 液体 气 -液色谱液相色谱 (LC)气相色谱 (
2、GC)色谱法（层析法） 利用物质在不同的两相中溶解、吸附、离子交换或其他亲和作用的差异而使混合物中各组分达到分离。（二）按 分离机理 分类吸附色谱 谱 (adsorption )：利用物理吸附性能的差异分配色谱 谱 (partition )：利用分配系数的不同离子交换色谱 (ion exchange )：利用离子交换原理分子排阻色谱 (size exclusion )：利用排阻作用力的不同（三）按 操作形式 分类柱色谱平面色谱 ： 薄层色谱纸色谱色谱法简单分类色谱法 液相色谱法超临界流体色谱法气相色谱法 毛细管柱色谱法填充柱色谱法柱色谱法平板色谱法逆流分配色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法薄
3、层色谱法纸色谱法三、色谱法的特点高选择性 可将性质相似的组分分开高效能 反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度 10-1110-13g， 适于痕量分析分析速度快 几 几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广 气体 ， 液体 、 固体物质化学衍生化再色谱分离、分析缺点： 对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用 (GC-MS,LC-MS)优点： “ 三高 ” 、 “ 一快 ” 、 “ 一广 ”色谱法的重要地位 19678 567 教材内容 药学领域的重要性 后期课程与考研中国药典2005年版二部中国药典2000年版二部收载品种 1967 1699HPLC 848 567经
4、典液相色谱： 固定相颗粒较大且不均匀常压下输送流动相柱效较低分析周期长现代液相色谱： 固定相颗粒小且均匀高压下输送流动相柱效较高分析周期短经典液相色谱法液相色谱法 ：以液体为流动相的色谱法称。第二节 柱色谱法一、液 -固吸附柱色谱法二、液 -液分配柱色谱法三、离子交换柱色谱法四、分子排阻柱色谱法一、液 -固吸附柱色谱法Adsorption Chromatography（一）分离原理各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离。组分 极性 吸附力 溶解度 冼脱次序1 大 强 小 后2 小 弱 大 先吸附 解吸 再吸附 再解吸 反复多次洗
5、脱 被测组分分配系数不同 差速迁移 分离1 + 2 1212（二）几个术语和公式1. 流出曲线和色谱峰流出曲线 （色谱图， chromatogram） ： 电信号强度随时间变化曲线色谱峰 ：流出曲线上突起部分基线 (baseline) ： 当没有待测组分进入检测器时的流出曲线（稳定 平直直线）2. 保留时间 tR保留体积 VR3.分配系数各组分具有不同的 K值是分离的基础。K与 T有关。4.保留比)()(msCCK溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度)()(RmttR溶质通过色谱柱的时间溶剂通过色谱柱的时间tR= tm + ts5 .保留体积、保留时间与分配系数的关系组分 吸附力 Cs K
6、 tR VR1 强 大 大 长 大2 弱 小 小 短 小tR是定性参数 ， 主要取决于组分的性质 。111111msmmssmssmmRmVVKVCVCtttttttR) 1(msmRVVKtt ) 1( smR KVVV 一定的色谱条件下， tm、 Vs、 Vm为定值， tR、 VR与K成线性关系（三）常用吸附剂：多孔、微粒状物质吸附剂吸附能力的大小取决于1.吸附中心的多少2.吸附中心于与被吸附物形成氢键的能力大小吸附中心 ，形成氢键能力 ，吸附能力 常用的吸附剂有 （ 1）硅胶；（ 2）氧化铝；（ 3）聚酰胺硅胶（ SiO2H 2O）结构 ： 内部 硅氧交联结构 多孔结构表面 有硅醇基 氢
7、键作用 吸附活性中心特性 ：吸水 形成水合硅醇基 失活 105 110 0C 烘干 30分钟 (可逆失水 ) 吸附力最大含水量越 大 ，活性级越 大 ，活性越 弱 ，吸附能力越 小适用： 分析酸性或中性物质（四）吸附剂和流动相的选择：依据被测组分、吸附剂和流动相的性质1.被测组分性质（极性大小）A.基本母核相同 基团极性 分子极性 极性基团数 分子极性 常见的化合物极性大小顺序 :烷烃 烯烃 醚类 硝基化合物 二甲胺 脂类 酮类 醛类 硫醇 胺类 酰胺 醇类 酚类 羧酸类B.分子双键数 ，共轭度 ，分子极性 C.取代基空间排列COO HOHCH O O HO被测成分极性 吸附剂活度 流动相极性
8、极性 小 极性非极性 大 非极性吸附剂的活性 ，对被测组分的吸附能力 强极性物质 选择弱吸附剂弱极性物质 选择强吸附剂流动相极性 ，对被测组分的洗脱能力 “ 相似相溶 ” 原则： 根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相2.吸附剂的活性：3.流动相的极性：二、液 -液分配柱色谱法Partition chromatography固定相 机械吸附在惰性载体上的液体流动相 必须与固定相不为互溶载体 惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离。K Cs/Cm注： K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温有关（一）原理连续萃取过程
9、K C醚 C水 溶质移动大 大 小 慢小 小 大 快1 分配色谱 比逆流分配 更有效 -分配次数更多2 分离速度更快： s与 m之间界面很大，分配达到平衡很快K=C乙醚 /C水（二）载体和固定相载体 （担体）： 惰性物质 ， 较大的比表面积， 常用硅胶、纤维素、 硅藻土。固定相 : 常用水、甲酰胺（三）流动相与固定相互不相溶的有机溶剂。可以单一也可混合液。如：石油醚、 醇类、 酮类、酯类、卤代烷烃。（需先用固定相饱和，否则固定相易流失。）例： 1941年 英国 Martin 和 Synge，诺贝尔奖硅胶吸附的水 氯仿 分离氨基酸Note：防止固定液的流失 , 常采用化学键合相。(四 ) 正相色
10、谱与反相色谱 :正相 反相固定相极性 大 小流动相极性 小 大流出顺序 极性小的组分先 极性大的组分先三、离子交换柱色谱法Ion exchang chromatography固定相： 离子交换树脂流动相： 水为溶剂的缓冲溶液分离对象： 离子型 化合物分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离 离子交换树脂 具有网状结构的高分子聚合物骨架联上酸性基团：阳离子交换树脂（ -SO3H , -COOH等 ）联上碱性基团：阴离子交换树脂（ -NH2 , -NHR等）阳离子 交换反应：（ 树脂可反复使用 ， 用 HCl浸泡 ， 冲洗 )阴离子 交换反应：( 阴离子树脂的再生 ,用
11、适当的碱液浸泡 ) N ( C H 3 ) 3+O H -R + C l - 变换洗脱N ( C H 3 ) 3+C l -R + O H -用酸液滴定 可求 X %H+应用 ： 1 除去干扰离子，如制备 去离子水 ；2 盐类的测定 如乳酸钠的测定。四、分子排阻柱色谱法Size exclusion chromatography固定相 ：多孔水凝胶流动相 水 凝胶过滤色谱流动相 有机溶剂 凝胶渗透色谱分离对象：较大分子尺寸的高聚物、蛋白质、多糖等分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。按分子大小分离 大分子先流出平面色谱法（ plane chromatography）
12、：是在平面上进行分离的一种分析方法平面色谱法一、定性参数比移值（ retardation factor， Rf）讨论 :（ 1）色谱条件一定， Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为；同一色谱条件下 , Rf值为常数（ 2） Rf与 K有关，即与组分性质（极性）以及薄层板和展开剂的性质有关；（ 3）影响 Rf的因素 组分的性质：一般来讲 极性 ， K ， Rf 固定相性质： 活性 ，吸附能力 ， Rf 展开剂极性：薄层板一定，对于极性组分展开剂极性 ， Rf （ 容易洗脱 ）展开剂极性 ， Rf （ 不容易洗脱 ） Rf=0 未移行 （ 被固定完全吸附 ， K ）
13、Rf=1 移至前沿 （ 组分不被固定相吸附， K 0） Rf范围： 0 Rf 1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）Rf=0.2 0.8（常用） 0.3 0.5（最佳）二、分配系数与 Rf的关系11 KVVSmR f =三、分离参数 分离度L1、 L2色斑中心到原点的距离 。W1、 W2两色斑的峰宽 。 一般亦可用纵向直径 。Rs=1.0 两斑点基本分离Rs=1.5 两斑点完全分离2/)() (2112WWLLRs第三节 薄层色谱法Thin Layer Chromatography TLC一、原理二、固定相三、展开剂的选择四、操作方法五、应用与示例一、原理 吸附 TLC1. 定义：
14、 将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2.操作过程：3分离机制： 吸附 （分配，离子交换，空间排阻）4特点：分析快速、灵敏、显色方便5应用：药物杂质检查、纯度测定二、固定相1硅胶硅胶 G 自含粘和剂硅胶 H 不含粘和剂，铺板时另加入 CMC硅胶 HF254或硅胶 GF254 含荧光剂， 254nm紫外光照发绿光硅胶 HF365或硅胶 GF365 含荧光剂， 365nm紫外光照发紫蓝光荧光板适用于本身不发光又无适当显色剂的物质2氧化铝三、展开剂的选择（同柱）1 .展开剂：有一种或多种溶剂按一定比例组成。2.选择：根据 被测组分、吸附剂和展开剂 本身的极性物质极性 吸附力 流动相极性 防止大 强 大 太牢 , Rf太小小 弱 小 Rf太大一般规则：(1)先用单一的中等极性展开剂试一下 。(2)改用二元展开剂 , 其比例要摸索 。目的：改变展开剂的极性 。例： 某一样品先用单一展开剂 如氯仿 Rf太大 加极性小的溶剂 氯仿 -环已烷（ 9： 1） Rf太小 加极性大的溶剂 氯仿 -甲醇（ 8： 2） 三元、四元溶剂 分离 酸 性物质加 酸 如甲酸、乙酸 分离 碱 性物质加 碱 如氨水、乙二胺一般 Rf 0.2 0.8例： A、 B两组分的试样展开剂 A B苯 Rf= 0.45 0.42 分不开苯 +乙醇 Rf= 0.38 0.52 可分开
