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1、浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月 13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的OD540值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗
2、糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；
3、正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖 ，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45-50，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提
4、取，使蔗糖酶得到初步的提纯。1.2 试剂与器材1.2.1试剂 啤酒酵母；醋酸钠（AR）；甲苯（AR）；4mol/L醋酸；95%乙醇（-20）；0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。1.2.2器材 锥形瓶250ml
5、（1），50ml（1）；量筒10ml（1）25ml（1）;烧杯100 ml（1），1000 ml（1）；具塞试管10 ml（3）；吸球、玻棒、滴管、pH试纸；培养箱；恒温水浴箱；磁力搅拌器，搅拌子；高速冷冻离心机。1.3操作方法 1 酵母的自溶 ：在弱碱中培养60小时； 2 初提取液A：取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A； 3 热提取液B：水浴提取液A，并使PH为4.5，离心得热提取液B4 乙醇沉淀提取液C：将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少于30min，离心得提取液C1.4结果与分析1.4.1结果表2-1提取液颜色状态体积（ml）A黄色液体17.0B浅黄色液体18.0C淡黄色液体8.27
6、VA总=VA=17.0ml VB总=VBVA/(VA-3)=18.0ml VC总=VcVA/(VA-3) VB/(VB-3)=VcVB总/(VB-3)=8.27ml 1.4.2分析 提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。1.4.3结论VA总=17.0ml ； VB总=218.0ml ； VC总=8.27ml。1.5注意事项第一次离心后取液体时要小心；水浴时的温度不要超过50。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰浴时要迅速操作；冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；1.6认识与体会 实验操作无明显错误，操作仍能精确
7、，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50C以上失活。2 蔗糖酶的纯化Q Sepharose-柱层析法2.1实验原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白
8、质被分开。分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。2.2试剂与器材2.2.2.1试剂 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；0.5mol/LNaOH；Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4保存。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。2.2.2.2器材 层析柱；梯度混合器;磁力搅拌器，搅拌子；紫外分光光度计；点滴板；尿糖试纸、擦镜纸；止水夹；烧杯、试管。 2.3操作方法 1离子交换柱的填充：将层析柱垂直固定，加水，排除气
9、泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。 2缓冲液盐度梯度发生器的安装：在低浓度一段装入搅拌子。且要形成梯度。3柱的平衡：将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。4加样：缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一5洗脱：为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。6测OD值：在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下： 表2-2试管号OD280值试管号OD280值10.322140.120 20.447150.10
10、9 30.060160.083 40.054170.077 50.065 180.069 60.031190.126 70.028 200.30580.016 210.900 90.037 221.014100.048 230.673 110.061 240.281120.231 25130130.2847酶活力测试用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取1、2、5、12、13、14、20、21、22、23管进行测试。 酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。将其合并成一管，V
11、D=5.22ml2.4结果与分析2.4.1结果 VD =5.22ml VD总=VDVC总/V样=5.66.1/0.5=86.34ml。由数据得表如下： 图2-1 Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表2.4.2分析 柱的高度与冲洗的流速、梅的浓度及柱的带电量大小会影响样品在柱内的移动快慢； 酶活力不是特别的强，也许是前面柱下端渗出液体导致蔗糖酶流失； 适当增加柱的高度与降低冲洗液的流速能提高分离效率； 在使用Q-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAE Sepharose层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose纯化方法有如下特点： (1) 提
12、高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。（2） 缩短实验时间。梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。（3） 节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千
13、次,因而降低了成本。2.4.3结论VD 5.22mlVD总 =86.34ml。2.5注意事项在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。当液面低 于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果；加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯；恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下滴过快而引起干柱。是绝对不能干柱；盐度梯度发生器内气泡要除尽；2.6认识与体会在本实验中，由于操作失误，导致柱内气压太大，加样时在柱的下端有液体流出，影响了本实验的准确性，使得D的酶浓度不高，影响后续实验，提纯也不好。 3 蔗糖酶活力的测定3.1实验原理本实验用DNS法测还原
14、糖的含量，进而计算酶的活力。蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。酶活力单位数（U）：在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*(试管溶液总体积/2)*V总*nV总为各种提取液在提取过程中的总体积。酶回收率=（各提取液的总酶
