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1、靶向超声微泡对肿瘤新生血管分子显像的研究 摘要 目的 探讨以KDR为靶点的靶向超声微泡对裸鼠结肠癌新生血管靶向显像效果。方法 “生物素-亲和素”桥接法将与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237与脂质微泡偶联构建靶向微泡。以KDR阴性表达的人结肠癌LS174T细胞株建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型。裸鼠经尾静脉随机注射靶向微泡、携随机序列对照肽的对照微泡，5min后行超声造影检查，观察各组微泡在肿瘤组织造影增强情况，测量肿瘤组织的声强度（VI）。另取6只裸鼠预先注射K237肽后再注射靶向微泡，观察微泡的显像效果。免疫组化技术检测KDR在肿瘤组织表达及分布规律。结果 成功制备了靶向微泡。注射超
2、声微泡5min显示靶向微泡组肿瘤组织显像明显增强，VI值与对照微泡组（VI）及封闭组(VI)比较均有显著差异（P0.05）；免疫组化显示，裸鼠结肠癌新生血管内皮细胞KDR表达较正常组织内皮细胞KDR表达显著增加。结论 以KDR为靶点的靶向超声微泡可以与肿瘤新生血管内皮特异性粘附并有效评价肿瘤新生血管形成。关键词 靶向微泡；超声造影；结肠癌；KDRMolecular imaging of tumor angiogenesis with targeted microbubbles 【Abstract】 Objective To evaluate effect of tumor neo-vascul
3、arization imaging in nude mice model of colon cancer by contrast ultrasound molecular imaging (UMI) of KDR expression.Methods A targeted microbubble（MBp）was builded by conjugding the small peptide K237 which has a high degree afffinity of KDR to liposome microbubbles through the bridging of biotin-a
4、vidin. A xenografted model of LS174T human colon cancer in nude mice was established.Twelve mice were injected intravenous of MBp and control microbubbles （MBc）in random order. MBp were injected in another six mice after K237-peptide blockage.After 5 minutes of intravenous injection of microbubble,
5、ultrasound imaging was performed in all mice to observe the imaging difference and measure the VI (video intensity) of tumor tissues in different MB groups.Immunohistochemistry was applied to detect the expression and distribution of KDR in breast tumor tissue and adjacent tumor tissues.Results K237
6、 peptide can be successfully conjugated to the surface of microbubbles through biotin-avidin mediation.Ultrasound imaging signal was significantly high in MBp group. And the VI of tumor tissues in MBp group showed remarkable difference compared to that in MBc group and K237-peptide blockage group (P
7、0.05).Immunohistochemistry showed KDR was highly expressed in tumor tissue and there was no significant expression of KDR in tissue surrounding tumor.Conclusion KDR-Targeted liposome contrast agent could specifically and efficiently combine with tumor vascular endothelial cells in vivo .It is a good
8、 method to assess tumor angiogenesis. 【Key words】Targeted microbubbles；Contrast-enhanced ultrasound；colon cancer；KDR实体瘤的生长和转移是血管依赖性的，以新生血管相关分子为靶点进行分子靶向超声显像以了解肿瘤血管生成状态，对评估预后、预测转移潜能、指导抗血管生成治疗及疗效监测有着重要意义。作为最重要的血管生长因子VEGF的主要受体,介导促进内皮细胞增殖、迁移、血管通透性增加等血管生成活性，在肿瘤血管生成过程尤其是早期阶段起着关键作用1-2。高表达于多数肿瘤新生血管内皮细胞，而在正常组
9、织血管内皮细胞中几乎不表达，提示KDR可能成为多数实体瘤新生血管特异性分子显像的靶标3-4。我们前期以生物素-亲和素桥接法将从噬菌体肽库中筛选到的与KDR有高亲和活性的12肽K237与脂质体微泡偶连，构建了靶向微泡，体外实验证实靶向微泡具有与靶细胞结合的高度特异性3。为进一步证实靶向微泡体内肿瘤新生血管靶向特异性，我们选择KDR阴性表达的人结肠癌LS174T细胞株【6-7】建立人结肠癌LS174T裸鼠移植瘤模型，探讨以肿瘤新生血管内皮为靶点进行靶向超声显像的可行性。材料与方法一、实验材料与仪器1实验动物与细胞 18只免疫缺陷型雌性小鼠，6-8周龄，由南方医科大学实验动物中心提供，饲养于SPF级
10、环境；人结肠癌细胞株LS174T，南方医院病理科实验室保存。2主要试剂 生物素化十二肽K237（杭州中肽公司）、二棕榈酰磷脂酰胆碱胆（DPPC，Sigma，美国）、聚乙二醇（PEG，Sigma，美国）、生物素化脂质体（DSPE-PEG-Biotin，Sigma，美国）、亲和素（Avidin，美国）、抗KDR抗体工作液（博士德）、新生小牛血清、0.25%胰蛋白酶、RIMP1640培养液。3实验仪器 荧光显微镜（Nikon Eclipe Ti-s，Japan）， Sequoia512超声诊断仪(Siemens，Germany)二、实验方法1超声微泡的制备将DPPC、PEG、DSPEPEGBioti
11、n交联物等按比例溶于蒸馏水，导入全氟丙烷气体，机械振荡处理，静置分层，弃下清液，纯化微泡3次，制备得到生物素化脂质微泡。参照文献【8】合成与KDR 有高亲和活性的氨基酸序列为“HTMYYHHYQHHL”的生物素化12肽K237及合成随机序列的对照肽（杭州中肽公司合成）。生物素化脂质微泡按比例加入链亲和素，纯化洗涤后再分别加入生物素化12肽或对照肽，制备出靶向微泡(MBp)和对照微泡(MBc)。按照我们之前建立的方法进行靶向微泡体外靶向性能鉴定【5,9】。2动物模型的建立 人结肠癌细胞株LS174T无菌培养于含10%新生牛血清的RIMP1640培养基中，37、5%CO2条件下的培养箱中培养。收集
12、处于对数生长期的细胞制成浓度为2.0x107个/ml的细胞悬液。6-8周龄雌性裸鼠18只，接种LS174T细胞，每鼠无菌条件下局部消毒，于裸鼠皮下第三对乳腺脂肪垫处缓慢注射0.2ml的瘤细胞悬液，见局部形成隆丘后退针，定期观察肿瘤生长情况。3超声造影检查瘤细胞接种10天行肿瘤超声造影检查。随机选取12只裸鼠以4%的戊巴比妥钠0.2ml腹腔麻醉，麻醉后裸鼠仰卧位固定于自制平台上，将探头放于支架上并调整探头使肿瘤能够良好显像后，固定探头，保证实验过程中探头位置不变。所有裸鼠经尾静脉分别随机注射2.0x108个/ml靶向微泡、对照微泡（各组微泡注射间隔30min【10】）。探头发射频率为10.0MH
13、z，机械指数（Mechanical Index, MI）为0.14，实验过程中各项参数保持不变。注入微泡5min后获取肿瘤声学造影第一帧图像，此后，以高MI连续超声发射23s破坏微泡后，继续存储图像3-4帧。取剩余6只瘤鼠，以0.2mlK237小肽（1mg/ml）预先注射30min封闭KDR结合位点后再注射2.0x108/ml靶向微泡0.2ml，造影方法及图像处理同前。4超声造影图像分析应用MCE软件对超声图像进行分析，测量实验裸鼠肿瘤显造影图像的声强度（video intensity, VI），其中第一帧图像的声强度值代表微泡在组织及循环中的总浓度，包括肿瘤组织的粘附和体内血液循环的微泡，高
14、机械指数超声波破坏后的声强度值为血液循环中的微泡浓度，前者减去后者即得到粘附在肿瘤组织中的微泡浓度。采用彩色编码技术制作肿瘤组织彩色编码图像。5免疫组化检查完成实验后处死裸鼠，所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，免疫组化检测肿瘤组织及距肿瘤2cm处正常组织内KDR表达及分布规律（SP法）。结果判定以胞浆或胞膜有明确棕黄色着色为阳性。6统计分析采用SPSS13.0分析软件进行统计分析，所有数据均以 x s表示。靶向微泡组、对照微泡组、小肽预先封闭组在肿瘤组织的VI值比较采用One-Way ANOVA，组间多重比较采用LSD检验。P0.05为差异有统计学意义。结 果1超声微泡理化性质制备得
15、到的靶向微泡(MBp)和对照微泡(MBc)光镜观察分布均匀，无聚集现象，单个微泡外观圆整。库尔特计数仪测得MBp浓度约为(5.171.0)x108个/ml，粒径为（2.010.93）m，MBc浓度约为（5.371.07）x108个/ml，粒径为（2.101.03）m。2动物模型情况注射肿瘤细胞10d左右，18只裸鼠均于注射部位形成肉眼可见的实体瘤，瘤体直径3-6mm，平均直径4.5mm。3超声造影检查彩色编码及VI值分析 彩色编码图像显示，注入微泡5min后可见MBp在肿瘤组织边缘及由边缘向内部延伸的显著超声造影增强，而MBc在肿瘤组织仅见轻度超声显影，K237小肽封闭后再注入MBp 5min
16、在肿瘤组织仅见轻度超声显影。注入微泡5min后MBp在肿瘤组织的VI值明显增高，而MBc在肿瘤组织的VI值未见明显增高，两者比较有统计学差异；经小肽预先封闭后，MBp在肿瘤组织的VI值明显降低，与未封闭组有显著差异（P0.05）。裸鼠肿瘤组织内彩色编码图见图1，声强度值见表1。 图1 裸鼠结肠癌移植瘤模型超声造影彩色编码图，A为注入微泡5min后，靶向微泡在肿瘤组织造影图像，为不均匀增强，以肿瘤周边为著；B为注入微泡5min后，对照微泡在肿瘤组织见轻度造影增强；C为小肽预先封闭后，注入靶向微泡5min后在肿瘤组织见轻度造影增强。 表1 裸鼠肿瘤超声造影检查声强度值分组 N MeanStd.ErrorMBp1832.6811.28MBc18
