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1、微生物学实验二微生物学实验二 病原生物学教研室 实验二 录像：细菌的耐药性质粒试验 观察上次实验结果、进行分析 操作： 1. 紫外线杀菌实验 （普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）接种血平板 材料： 1. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 2. 大肠杆菌斜面培养物（1支/6人） 3. 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 空气中细菌的检查 菌落计数的方法 据推算，每100cm培养基在空气中暴露5分钟，其 表面接受自然沉降的细菌数约相当于10升空气中 所含的细菌量。 每块平板的菌落数=4块平板
2、的菌落总数/4 100cm面积培养基上的菌落数=（每块平板的菌落 数/r）x100 每m空气中活菌数= （100cm培养基上菌落平均 数/30）x1000 鼻咽喉及口腔中细菌的检查 咳碟试验 观察平板上可有不同的菌落长出。菌落直径 大小，形状（圆形或不规则），透明度（半透明 、不透明或透明），硬度（粘稠或易碎），表面 （光泽、粗糙、平滑、凸起、凹下、干燥、湿润 等），边缘（整齐、不整齐），颜色（色素）， 菌落与培养基的关系（粘连、溶血与否）。 正常人体皮肤及随身物品的细菌检查 结果：通常除用碘液消毒的手指外，其余手 指或杂物接触的培养基表面都有数量不等的菌落 长出。观察菌落直径大小，形状，透明
3、度，硬度 ，表面，边缘，颜色（色素），菌落与培养基的 关系等。 细菌的分离接种 1）观察细菌在固体琼脂平板培养基上的生长状态：观察平 板上可有不同的菌落长出。菌落直径大小，形状（圆形或 不规则），透明度（半透明、不透明或透明），硬度（粘 稠或易碎），表面（光泽、粗糙、平滑、凸起、凹下、干 燥、湿润等），边缘（整齐、不整齐），颜色（色素）， 菌落与培养基的关系（粘连、溶血与否）。 2）观察细菌在半固体琼脂培养基上的生长状态：注意在穿 刺线上细菌生长的状态，清晰（无动力）或向四周扩散（ 有动力）。 3）观察细菌在肉汤培养基上的生长状态：有无菌膜、菌膜 厚度，混浊度，有无沉淀、沉淀的性质是絮状、粘液
4、状或 颗粒状。 物理消毒灭菌法： 热力灭菌法 湿热灭菌法：巴氏消毒法、煮沸法、流动蒸气 消毒法、间歇蒸气灭菌法、 高压蒸气灭菌法 干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤 电磁波辐射杀菌法 紫外线 电离辐射 滤过除菌法 超声波杀菌 干燥 紫外线杀菌原理: 波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中以265 266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。紫外线主要作 用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合而 形成双聚体,因而改变DNA的分子构型，干扰DNA的复制与 转录，导致细菌的死亡或变异。 注意: 1 穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水蒸气均 能阻挡。 2 适用于病房、无菌室、手
5、术室、实验室空气、地 面等的消毒。 3 有效距离2米左右（紫外灯的安装）。 4 紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。 划线、盖纸、照射 一、紫外线杀菌 操作： 1. 取普通平板，1块/3人 2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线 3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 照射后放37孵箱培养 6. 观察结果 7. 注意操作中始终保持无菌操作 遗传与变异是所有生物的共同生命特征。遗传 使生物的性状保持相对稳定，且代代相传，使其种 属得以保存。另者，在一定条件下，子代与亲代之 间、子代与子代之间的生物学形状可以出现差异， 称之为变异。变异可以使生物产
6、生新变种，变种的 新特性靠遗传得以巩固，并使物种得以发展与进化 。细菌也是一种生物，其形态结构、生理代谢、致 病性、耐药性、抗原性等性状都是由细菌的遗传物 质所决定。 细菌遗传变异的物质基础是染色体内的DNA和 染色体外的质粒DNA及转位因子等。染色体内的 DNA凭借其构成的特定基因来传递遗传物质；而染 色体外的遗传物质质粒DNA和转位因子等，对 细菌的遗传与变异也起着重要的作用。 质粒是环状闭合的双链DNA ，经人工抽提后 可变成线状或开环状。质粒基因可编码很多重要 的生物学性状，其中，耐药性R质粒可以通过细菌 间的接合传递某些信息，使细菌对抗菌药物或某 些重金属盐类产生耐药性。质粒可以自我
7、复制， 也可自行丢失或消除。 细菌的变异可分为遗传性与非遗传性变异。 遗传性变异是细菌的基因结构发生了改变，如基 因突变或基因转移与重组等所以又称之为基因型 变异；非遗传性变异是细菌在一定的环境条件影 响下产生的变异，其基因结构未改变，故又称之 为表型变异。基因型变异常发生于个别的细菌， 不受环境因素的影响，变异发生后是不可逆的， 产生的新性状可稳定的遗传给后代。而表型变异 易受环境因素的影响，凡是在此环境因素作用下 的所有细菌都出现变异，而且当环境中的影响因 素去除后，变异的性状又可复原，表型变异不能 遗传。 细菌的变异现象有： 1、形态结构的变异： 如细菌的L型变异、H-O变异（失去鞭毛的
8、变异 ）、肺炎球菌经体外多代培养后失去荚膜现象等， 此类变异是可逆的。 2、菌落变异： 肠道杆菌的S-R变异，即菌落由光滑型变为粗 糙型。 3、毒力变异： 如卡介苗，乃是将有毒的牛分枝杆菌在含有甘 油、马铃薯培养基上，经13年，连续传代230 次，而获得的毒力减弱但仍保持免疫原性的变异株 。 4、耐药性变异： 指的是原来对某种药物敏感的菌株 ，由于多种原因，例如细菌基因的改变 、诱导酶的形成或者是耐药性质粒的传 递等，而对同种药物发生变异，形成耐 药菌株，甚至变成赖药菌株。 二、抗生素敏感试验 随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌 株日益增加（尤其是金葡、肠道杆菌）， 给医疗工作带来了不少的困难。 为正确使用抗生素，临床上常在分离 致病细菌的同时做药物敏感试验，以了解 该细菌对常用各种抗生素的敏感性。 药敏试验的常用方法：纸片法 操作： 贴纸片 结果分析： 如果细菌对药物敏感，则在药片周 围有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直 径越大： 20mm：极度敏感 抑菌圈直径 1520mm：中度敏感 1015mm：轻度敏感 10mm: 不敏感 无抑菌圈 为耐药 思考题 1. 临床上遇到了耐药性菌株，应 采取什么措施？ 2. 耐药性质粒是通过哪几种方式 传递的？ 3. 抗生素耐药性结果是如何判定 的？
