七氟醚预处理抑制tnfα诱导的血管内皮细胞炎症反应及机制的研究

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1、中南大学 博士学位论文 七氟醚预处理抑制TNF-诱导的血管内皮细胞炎症反应及机制 的研究 姓名：李锁北 申请学位级别：博士 专业：麻醉学 指导教师：徐军美 20100501 博士学位论文 中文摘要 摘要 研究目的( 1 ) 建立人脐静脉内皮细胞( H U V E C ) 体外培养方法， 探讨肿瘤坏死因子一a ( T N F a ) 对H U V E C 表达细胞间粘附分子 ( I C A M 1 ) 、血管细胞间粘附分子( V C A M 1 ) 的影响，筛选出T N F a 诱导粘附分子表达的最适浓度和时间；研究七氟醚预处理对H U V E C 表达I C A M 1 、V C A M 1

2、及中性粒细胞粘附的影响；( 2 ) 研究七氟醚 预处理对T N F 0 【诱导的血管内皮细胞N F r , B 信号转导通路激活的影 响，为七氟醚预处理抗炎作用的机制提供理论和实验依据；( 3 ) 探讨 e N O S - N O 信号系统对七氟醚预处理在体外培养的血管内皮细胞抗炎 效应的影响。 研究方法实验分为三个部分：( 1 ) 原代细胞培养参照参考文献 报道方法并加以改进，通过形态学观察和免疫细胞化学法对细胞进行 鉴定；应用W e s t e r nb l o t 及实时荧光定量P C R 方法，检测不同浓度 n 师Q ( 0 、l n g m l 、2 5 n g m l 、1 0 n

3、 g m l 、4 0 n g m 1 ) 处理内皮细胞4 小时，以及T N F 0 【( 1 0 n g m 1 ) 作用不同时间( 0 、2 h 、4 h 、1 2 h ) 后 I C A M 一1 、V C A M 1 蛋白及m R N A 的表达，确定T N F a 诱导血管内皮 细胞粘附分子稳定表达的最佳作用浓度和时间；然后将体外培养的 H U V E C 分为空白对照组、1 5 M A C 七氟醚组、1 0 n g m lT N F 0 【组以及 10 n g m ln 盯叶O 5 M A C 、1 5 M A C 或2 5 M A C 七氟醚预处理组，分 别检测七氟醚对T N F

4、 仅诱导H U V E C 表达粘附分子及中性粒细胞粘 附的影响。( 2 ) 应用核浆分离技术和W e s t e r nb l o t 方法，观察1 0n g m l T N F 0 【刺激对m E C 的I r d 3 a 、P I r , B a 、核浆胞浆内N F r , B p 6 5 亚 基蛋白水平的影响及其时间趋势；将体外培养的H U V E C 分为空白对 照组、1 5 M A C 七氟醚单独刺激组、1 0 n g m lT N F 仅单独刺激组以及 1 5 M A C 七氟醚预处理组，检测各组细胞I r , B 0 c 、P I r , B 仅以及核浆 胞浆内N F r ,

5、B P 6 5 亚基蛋白在各自变化高峰时点的水平。( 3 ) 分别以 0 、0 5 M A C 、1 5 M A C 和2 5 M A C 七氟醚预处理体外培养的H U V E C ， 应用w e s t e r nb l o t 法检测p - e N O S 和e N O S 的蛋白水平，G r i e s sr e a g e n t 法检测细胞培养上清液中总N O 含量，D A F F MD A 荧光探针法检测 细胞内的N O 含量；将体外培养的H U V E C 分为1 0 n g m lT N F Q 单独 刺激组、1 5 M A C 七氟醚+ 1 0 n g m ln 晒a 刺激组

6、、e N O S 抑制剂 L - N A M E 组，并检测各相应时点的细胞培养上清液中总N O 含量、细 博士学位论文中文摘要 胞内N O 含量以及p - e N O S e N O S 、I r B 帅1 1 ( B a 、核浆胞浆内 N F r , B P 6 5 蛋白水平以及I C A M 1 W C A M 1 的蛋白、m R N A 水平和中 性粒细胞与H U V E C 的粘附率，确定e N O S - N O 信号系统是否介导了 七氟醚预处理在血管内皮细胞的抗炎作用。 研究结果( 1 ) 改良的H U V E C 的体外培养方法是成功的，经相 差显微镜观察以及因子染色证实培养的

7、细胞( 9 7 5 ) 为H U V E C ，1 0 n g m l 的T N F Q 处理H U V E C 后，V C A M 1 、I C A M 1 在4 h 明显升 高，之后稳定表达，台盼蓝染色显示9 5 以上细胞存活良好，T N F G t 诱导H U V E C 稳定表达粘附分子的最佳作用浓度为l O n g m l ，时间为 4 h 。与T N F Q 单独刺激血管内皮细胞比较，1 5 、2 5 M A C 七氟醚 预处理明显降低T N F Q 诱导血管内皮细胞的I C A M 1 和V C A M 1 蛋 白及m R N A 表达水平，并降低了中性粒细胞粘附率( P O 0

8、 5 ) 。( 2 ) 1 0n g m ln 盯0 【刺激内皮细胞后，I r B a 发生降解，同时磷酸化水平上 调，随之p 6 5 亚基向核内移位，I r d 3 t L 降解及磷酸化水平上调的时间 高峰为3 0 分钟，p 6 5 亚基入核的高峰时间为6 0 分钟( P O 0 1 ) ；在各 检测指标变化的高峰时点，与空白对照组比较，1 5 M A C 七氟醚单独 刺激组细胞的I r B a 蛋白降解、P I r , B a 蛋白水平以及N F r , B p 6 5 蛋白 亚基的入核没有显著变化，而1 5 M A C 七氟醚预处理组I r , B a 蛋白降 解、p - I r , B

9、 a 蛋白水平以及N F r B p 6 5 蛋白亚基的入核较耵师0 【单独 刺激组的有明显抑制( P 0 0 5 ) 。( 3 ) 与空白对照组比较，1 5 M A C 和2 5 M A C 七氟醚预处理组的P e N O S 的表达明显增加，且 P e N O S e N O S 比值有显著性增高( P O 0 5 ) ，且细胞培养上清液中总 N O 含量显著增加( P O 0 5 ) ，细胞内N O 含量有明显增加；与七氟醚 预处理组比较，L - N A M E 组的细胞内P e N O S e N O S 、N O 含量及细胞 培养上清液中总N O 含量明显下降( P O 0 5 )

10、，同时，细胞的I r , B a 蛋 白降解、p - I r B a 蛋白表达水平以及N F r B p 6 5 蛋白亚基的入核、 I C A M I V C A M 1 的蛋白及m R N A 水平和中性粒细胞粘附率均有显 著性增加( P 0 0 5 ) 。 研究结论( 1 ) 七氟醚预处理抑制T N F a 诱导的血管内皮细 胞粘附分子表达及与中性粒细胞的粘附；( 2 ) 七氟醚预处理下调 T N F 0 【诱导的内皮细胞N F r , B 信号通路激活，这可能介导了七氟醚 预处理在T N F 0 【诱导的血管内皮细胞炎症反应中的抗炎作用；( 3 ) 七氟醚预处理促进血管内皮细胞e N O

11、 S 磷酸化和随后的N O 生成，进 而抑制T N F 0 【诱导的N F r d 3 信号通路的激活，减轻了血管内皮细胞 博士学位论文 中文摘要 炎症反应。 关键宇七氟醚，血管细胞内皮细胞，细胞粘附分子，核因子1 ( B ， 内皮型一氧化氮合酶 I I I 博士学位论文 英文摘要 A B S T R A C T O b j e c t i v e ( 11 ) T oe s t a b l i s hc u l t u r i n gt e c h n i q u eo fm E C si nv i t r o T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t

12、 so fT N F Qo nt h ee x p r e s s i o no fI C A M 一1 ， V C A M 1o fm E Csa n dt h e nt od e c i d et h eo p t i m a la c t i o nt i m ec o u r s e a n dc o n c e n t r a t i o n T oi n v e s t i g a t et h ei n h i b i t o r ye f f e c t so fs e v o f l u r a n e p r e t r e a t m e n tw i t hd i f

13、f e r e n tc o n c e n t r a t i o no nt h ee x p r e s s i o no fI C A M 一1 ， V C A M 1i n T N F 0 【i n d u c e dH U V E C sa n dn e u t r o p h i l sa d h e s i o n t o H U V E C si n d u c e db yT l 、I F 0 【( 2 ) T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fs e v o f l u r a n e p r e t r e a t m

14、 e n to nt h ea c t i v i t yo f N F - 1 ( Bs i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yi n T N F 0 【i n d u c e dm E C s S Oa st op r o v i d et h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a l e v i d e n c ef o rt h em e c h a n i s mo fa n t i i n f l a m m a t o r ye f f e c t so fs e v o f i

15、 u r a n e p r e t r e a t m e n t ( 3 ) T oe x p l o r et h ee f f e c t so fe N O S N Os i g n a ls y s t e mo n a n t i i n f l a m m a t o r ye f f e c t so f s e v o f l u r a n e p r e t r e a t m e n t o nv a s c u l a r e n d o t h e l i a lc e l l si nv i t r o M e t h o d sT h es t u d yi

16、Sd i v i d e di n t ot h r e ep a r t s ：( 1 ) H E C sw e r e c u l t u r e da c c o r d i n gt or e f e r e n c e sw i t hm i n o rm o d i f i c a t i o n s E n d o t h e l i a l c e l l sw e r ei d e n t i f i e db yb o t hm o r p h o l o g ya n di m m u n o c y t ：o c h e m i c a l s t a i n i n gr e s p o n s e t of a c t o r r e l a t e da n t