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1、2011/12/27 1 第 十 七 章 分子生物学基本技术 第 十 七 章 分子生物学基本技术 Chapter 17 Basic Techniques of Molecular Biology 第一节 分子杂交第一节 分子杂交 Section 1 Molecular Hybridization 一、核酸分子杂交一、核酸分子杂交 1. 核酸分子杂交基本原理核酸分子杂交基本原理核酸变性与复性核酸变性与复性 核酸变性核酸变性(denaturation)：由于外界因素影响，使核 酸分子的空间结构改变，并引起核酸理化性质和生 物学功能发生改变的现象。其本质是维持核酸空间 ：由于外界因素影响，使核 酸分
2、子的空间结构改变，并引起核酸理化性质和生 物学功能发生改变的现象。其本质是维持核酸空间 结构的结构的氢键和氢键和/或碱基堆积力或碱基堆积力受到破坏。受到破坏。 核酸复性核酸复性(renaturation)：变性核酸在适当条件下根 据碱基配对原则重新恢复空间结构的过程。复性可 使核酸的理化性质得到恢复。 ：变性核酸在适当条件下根 据碱基配对原则重新恢复空间结构的过程。复性可 使核酸的理化性质得到恢复。 变性变性 复性复性复性复性 DNA的变性与复性的变性与复性 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 2 DNA的局部变性的局部变性 核酸变性因素：
3、加热 核酸变性因素： 加热 pH 有机溶剂有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺、丙酰胺等如乙醇、尿素、甲酰胺、丙酰胺等)等等 核酸复性因素核酸复性因素核酸复性因素核酸复性因素： 核酸序列复杂程度：越简单复性越快 核酸片段的大小：越小复性越快 核酸浓度：浓度越高复性越快 离子强度：强度越高复性越快 ： 核酸序列复杂程度：越简单复性越快 核酸片段的大小：越小复性越快 核酸浓度：浓度越高复性越快 离子强度：强度越高复性越快 增色效应增色效应(hyperchromic effect)：核酸变性时，由于碱基 外露使 ：核酸变性时，由于碱基 外露使260nm处的紫外吸收值增加，这种现象称为增色 效应。反之，称为
4、 处的紫外吸收值增加，这种现象称为增色 效应。反之，称为减色效应减色效应(hypochromic effect)。 1.4 m 肺炎球菌肺炎球菌 (38% G+C) 粘质沙雷菌粘质沙雷菌 (58% G+C) 不同来源不同来源DNA热变性时的增色效应热变性时的增色效应 708090100 1.0 1.2 A260nm 温度() 大肠杆菌大肠杆菌 (52% G+C) (58% G+C) 草分枝杆菌草分枝杆菌 (66% G+C) 熔解温度熔解温度(melting temperature，Tm)：指：指50 DNA双 链变性时的温度，也称解链温度或变性温度。此时溶液 的紫外吸收值达到最大值的一半。 双
5、 链变性时的温度，也称解链温度或变性温度。此时溶液 的紫外吸收值达到最大值的一半。 变 性 比 变 性 比 率率 100 DNA的热变性的热变性 率率 ( ) 50 0 758085 温度温度() TmTm CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 3 影响影响Tm值的因素： 值的因素： DNA的均一性 均一 的均一性 均一DNA解链温度范围较不均一解链温度范围较不均一DNA窄窄 DNA中的中的G+C含量含量DNA中的中的G+C含量含量 Tm69.30.41x(G+C) x(G+C)为为(G+C)的摩尔分数 溶剂的性质 离子强度低， 的摩尔分数 溶
6、剂的性质 离子强度低， Tm较低，且溶解温度范围窄较低，且溶解温度范围窄 核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)：两个不同来源、具有互 补碱基序列的单链核酸分子形成双链核酸分子的过程。 ：两个不同来源、具有互 补碱基序列的单链核酸分子形成双链核酸分子的过程。 混合后复性混合后复性 核酸杂交核酸杂交 杂合双链杂合双链 退火退火(annealing)：DNA在热变性后，经缓慢冷却，并 将温度维持在一定范围 在热变性后，经缓慢冷却，并 将温度维持在一定范围 ( 一般比一般比Tm低低2530左右左右 ) 时，单链时，单链DNA可重新恢复双链结构。可重新恢复双链结构。 2 核酸分子杂交中
7、的探针核酸分子杂交中的探针(probe)2. 核酸分子杂交中的探针核酸分子杂交中的探针(probe) (1) 核酸探针核酸探针的概念的概念 能与特定的靶分子能与特定的靶分子(DNA或或RNA)发生特异性结合的 核酸分子。 发生特异性结合的 核酸分子。 (2) 核酸探针的种类与应用核酸探针的种类与应用 据探针的来源和性质：基因组据探针的来源和性质：基因组DNA探针、探针、cDNA探 针、 探 针、RNA探针及寡核苷酸探针。探针及寡核苷酸探针。 探针应用原则：探针与被检测的目的核酸之间在核探针应用原则：探针与被检测的目的核酸之间在核 苷酸序列上要具有高度的特异性苷酸序列上要具有高度的特异性。苷酸序
8、列上要具有高度的特异性苷酸序列上要具有高度的特异性。 基因组 基因组DNA探针探针 根据实验目的选择基因组中的一段根据实验目的选择基因组中的一段DNA序列，并将 此 序列，并将 此DNA序列克隆至工程菌经扩增后可获得大量探针。序列克隆至工程菌经扩增后可获得大量探针。 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 4 cDNA探针探针 cDNA (complementary DNA)：以：以mRNA为模板， 经逆转录产生的能与模板互补的 为模板， 经逆转录产生的能与模板互补的DNA链。链。 cDNA 探针无内含子，尤适用于基因表达的检测。探针无内含子，尤
9、适用于基因表达的检测。 RNA探针探针 通常利用体外转录体系，以通常利用体外转录体系，以cDNA为模板制备。为模板制备。 优点是探针为单链，具有很高的杂交效率。优点是探针为单链，具有很高的杂交效率。 缺点是缺点是RNA易于降解，标记方法复杂。易于降解，标记方法复杂。 寡核苷酸探针 寡核苷酸探针 在体外经人工合成的单链在体外经人工合成的单链DNA分子，可与靶分子中 的一段序列互补。 分子，可与靶分子中 的一段序列互补。 (3) 核酸探针的标记核酸探针的标记(3) 核酸探针的标记核酸探针的标记 标记物 标记物 同位素标记物：同位素标记物：32P、3H、35S、14C、125I、131I。 非放射性
10、标记物：地高辛、生物素和荧光素。非放射性标记物：地高辛、生物素和荧光素。 O CH2O 32P OPO 32P O(35S) O- O(35S) O- O(35S) O- O- 碱基碱基 32P及 及35S标记的标记的NTP结构图结构图 OH O O 连接臂连接臂 地高 辛甾 地高 辛甾 O OH OPOPOP -O O O- O O- O O- HN N O O N H H N O O O O OH 4Li dUTP 连接臂连接臂 敏感性酯键 醇半 抗原 敏感性酯键 醇半 抗原 Dig-dUTP . 用用T4多核苷酸激酶进行末端标记 多核苷酸激酶进行末端标记 . 切口平移法 切口平移法 .
11、随机引物法 随机引物法 . 粘性末端法 标记方法 粘性末端法 标记方法 . 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)法法 (4) 标记探针的检测 放射自显影技术 免疫法检测 标记探针的检测 放射自显影技术 免疫法检测 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 5 3. 核酸杂交常用方法核酸杂交常用方法 (1) Southern 杂交杂交(Southern blotting) 也称也称Southern印迹，由印迹，由E.M. Southern发明，本质 为发明，本质 为 DNA-DNA杂交，基本过程为：杂交，基本过程为： 限制酶 消化 限制酶 消化 电泳电
12、泳 强碱 变性 强碱 变性 转膜转膜 杂交杂交洗膜洗膜 曝光或 显色 曝光或 显色 重物重物 Southern杂交图解杂交图解 限制酶消化 凝胶电泳 限制酶消化 凝胶电泳 吸水纸 膜 凝胶 塑料膜 滤纸 缓冲液 吸水纸 膜 凝胶 塑料膜 滤纸 缓冲液固相支持物固相支持物 杂交 洗膜 曝光 杂交 洗膜 曝光 植 物 限 植 物 限 制制 DNA 制制 酶 消 化 图 谱 酶 消 化 图 谱 Dig标记探针的杂交结果标记探针的杂交结果 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 6 放 射 自 放 射 自 显显显显 影 照 片 影 照 片 (2) Nor
13、thern杂交杂交(Northern blotting) 也称为也称为Northern印迹，本质为利用印迹，本质为利用DNA探针分析探针分析 RNA样品，基本过程为：样品，基本过程为： 分离纯分离纯 电泳电泳转膜转膜变性变性 分离纯分离纯 化化RNA 电泳电泳转膜转膜 杂交杂交洗膜洗膜 曝光或 显色 曝光或 显色 变性变性 在生物芯片在生物芯片(biochip)中采用光导原位合成或微量点样等 方法，将大量生物大分子有序地固化于支持物表面，组 成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中 中采用光导原位合成或微量点样等 方法，将大量生物大分子有序地固化于支持物表面，组 成密集二维分子排列，然
14、后与已标记的待测生物样品中 (3) 微阵列微阵列(microarray) 靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快 速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的 数量。此类技术又被统称为微阵列。 靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快 速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的 数量。此类技术又被统称为微阵列。 DNA微阵列实验流程图：微阵列实验流程图： 阵列的制作阵列的制作 (将确认后的序列自动 印制在载玻片或膜上 将确认后的序列自动 印制在载玻片或膜上) 靶标的制备靶标的制备 杂交杂交 扫描 检测 扫描 检测 结果 分析 结果 分析 靶标的制备靶标的制备 (样品
15、的提取与标记样品的提取与标记) DNA微阵列微阵列(芯片芯片)的应用：新基因发现、基 因诊断、药物筛选、个性化给药 的应用：新基因发现、基 因诊断、药物筛选、个性化给药 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 7 酵母 在孢 子形 酵母 在孢 子形 成期成期成期成期 基因 表达 分析 基因 表达 分析 (4) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization) 在细胞和组织内的原始位置进行杂交检测，靶序列无 需分离或纯化。 在细胞和组织内的原始位置进行杂交检测，靶序列无 需分离或纯化。 包括染色体原位杂交和组织原位杂交两类。包括染色
16、体原位杂交和组织原位杂交两类。 通常用于定位胞浆内通常用于定位胞浆内mRNA分析基因表达分析基因表达通常用于定位胞浆内通常用于定位胞浆内mRNA，分析基因表达分析基因表达。 基本步骤：基本步骤： 组织切片组织切片杂交杂交洗涤洗涤显微观察显微观察 染色体原位杂交是在染色体上定位基因或DNA序列： 染色体染色体变变 RNase和 蛋白酶 和 蛋白酶K 甲酰胺甲酰胺 染色体染色体显 微片 显 微片(干燥干燥) 除除RNA 和蛋白质和蛋白质 变变性性 DNA 洗涤洗涤观察分析观察分析 杂交杂交 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 CPU 的生化教研室 2011/12/27 8 4. 核酸分子杂交的应用： 核酸杂交遵循碱基配对原则，决定了核酸杂交的特异 性；此外核酸杂交可以在 核酸分子杂交
