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1、军事医学科学院研究生学位论文独创性声明 秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论 文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特 别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得芏主堕堂銎堂瞳或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 论文作者签字：蟊垒整 签字日期：竺应年月L 日 军事医学科学院保护知识产权声明 本学位论文作者完全了解芏主匡堂銎堂睦对研究生在学其间撰写的论 文知识产权保护的相关规定。本人撰写的论文是在导师具体指导下
2、，并得到 相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知 识产权单位属芏主匡堂銎堂瞳。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表 论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为芏主匡堂盘堂瞳。芏主匡 堂盘堂瞳有权保留学位论文及其电子版，公布论文的全部或部分内容，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存论文、汇编以供查阅和借阅。 ( 保密学位论文在解密后适用本声明) 论文作者签字： 指导教师签字： 签字日期： 竺f ! 年上月丛日 签字日期：丝翌年月上日 A S P C R 检测H I V - I 微量耐药突变方法的建立和初步应用 D e v e l o p m e n ta n dA
3、 p p l i c a t i o no fA S P C R f o rT e s t i n go fM i n o r H I V - 1D r u gR e s i s t a n c eM u t a t i o n s 研究生姓名郭东星 年级2 0 0 7 级 导师李敬云研究员 申请学位 专业名称 起止日期 理学硕士 微生物学 2 0 0 7 8 2 0 10 5 军事医学科学院微生物流行病研究所 目录 英文缩略词表 中文摘要1 英文摘要”4 前言：“7 刖罱“， 论文正文 第一部分 A S P C R 方法的建立及验证”1 5 材料和方法1 5 结果”2 7 讨论一3 9 结论
4、”4 1 第二部分 A S P C R 方法在检；坝d H I V - 1 微量耐药突变中的应用4 2 材料和方法”4 2 结果4 3 讨论“6 7 结论“6 9 参考文献7 0 文献综述7 5 代表性论著”8 3 个人简历8 8 致谢8 9 硕士学位论文 硕士学位论文摘要 A S P C R 检测H I V - 1 微量耐药突变方法 的建立和初步应用 中文摘要 在艾滋病抗病毒治疗前期或治疗过程中及时了解H I V 耐药毒株存在和发生 情况，对抗病毒治疗方案的制定具有很好的指导作用。检测劣势耐药毒株可以更 好地了解耐药性产生的机理并及时地指导临床抗病毒治疗，尽可能延缓病人耐药 的出现。目前常用
5、的H 耐药检测方法是以测序为基础的基因型分析方法，如h 1 - h o u s e 法和V i m S e q 基因型耐药检测系统。这些方法在耐药毒株占病毒准种的 2 0 “ - - 3 0 以上时才能检出，不能检出微量耐药突变，不能满足临床早期诊断耐 药及研究耐药进化路径的需要。相对于基因型分析方法，A l l e l e - s p e c i f i cr e a l - t i m e P C R ( A S P C R ) 方法能够高效检出微量( 0 0 1 1 ) 耐药病毒准种。本研究针对 我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中最常见的K 10 3 N 、M 18 4 I M 18 4
6、V 、 T 2 1 5 F T 2 1 5 Y 耐药突变位点，建立了A S P C R 检测耐药突变的方法，验证了这个 方法的特异性、灵敏度、准确性和重复性。使用建立的A S P C R 方法对7 6 侈1 J 接受 抗病毒治疗的艾滋病患者进行了耐药突变毒株检测及其占病毒准种比例的分析， 并对1 0 例艾滋病患者的系列样本( 共6 4 份) 进行了5 个耐药突变发生发展的监测。 第一部分A S P C R 力i “ 法的建立及验证 建立了A S P C R 检测5 个常见耐药突变的方法，包括：( 1 ) 设计并制备主要试 验材料。以H I V - 1p N L 4 3 质粒为模板，分别扩增两端
7、都带有酶切位点的并且含1 0 3 、 1 8 4 、2 1 5 位点的D N A 片段，将其连接到喊体，进行定点诱变并转化测序，得到 含K 1 0 3 N 、M 1 8 4 I M 1 8 4 V 、T 2 1 5 F T 2 1 5 Y 耐药突变的质粒作为标准品。设计特 异性和非特异性的引物用以区分野生型和突变型质粒。制定S Y B Rg r e e n 荧光法进 行实时定量P C R ，检测上述耐药突变的流程和结果判定标准。( 2 ) 对建立的A S P C R 方法检测各个突变位点的特异性、灵敏度、准确度、重复性等进行验证，包括用 构建的含有耐药突变的质粒进行的验证、用传统基因型方法检测
8、存在相应耐药突 变的样本和野生型病毒培养上清进行的验证和构建并包装含有突变的病毒及在 硕士学位论文 摘要 病毒水平上的验证。在病毒水平上的验证，做法是，将经过测序鉴定的带有突变 位点的片段从喊体上双酶切下来，并与经过处理的p N I A - 3 的骨架进行连接，然 后转染2 9 3 嘞胞，得到了野生型病毒和含相应耐药突变位点的假病毒。测定含有 K 1 0 3 N 、K 1 0 3 K 和M 1 8 4 I ( 本室保存) 的包装病毒的病毒载量，将含耐药突变的 病毒与野生型病毒根据载量按比例混合，提取混合病毒的R N A ，进行一步法逆转 录，对稀释后的第一轮P C R 产物进行实时定量检测，在
9、病毒水平上验证方法的准 确性和灵敏度。主要结果如下： 1 、建立了A S P C R 检测5 个常见H I V - 1 耐药突变( K 1 0 3 N 、M 1 8 4 I M 1 8 4 V 、 1 2 1 5 F T 2 1 5 Y ) 的方法，构建了5 个耐药突变的标准质粒、设计了特异性和非特 异性引物、制定出检测流程和结果判定标准。用这个方法能够准确地检测出标本 中是否含有某种耐药基因突变及携带耐药突变的毒株占病毒准种的比例。 2 、A S P C R 标准品制备良好，标准曲线的相关系数，均大于0 9 9 ，能够准确反映模 板量和C 值间的线性关系，可以用于待测样本的定量。 3 、各个
10、突变位点的特异引物对野生型和突变型模板具有良好的分辨力、准确性 和重复性，批次间和同批次内的变异系数均低于o 4 2 。 4 、质粒水平验证结果显示，A S P C R 检测K 1 0 3 N 、T 2 1 5 F 、T 2 1 5 Y 的灵敏度可达 0 0 4 。0 0 3 和0 0 2 ；检测M 18 4 v 和M 1 8 4 I 的灵敏度可达O 4 和0 3 。 5 、在病毒水平验证结果显示，A S P C R 检测源1 1 s 类耐药位点K 1 0 3 N 的灵敏度可 达0 0 2 左右，检测N R T I s 类耐药位点M 1 8 4 I 的灵敏度可i 大o 0 1 。且混合病毒的
11、A s P C R 测定比例与理论比例具有良好的一致性。因此，A S P C R 方法的前期流程 ( 对峪提取、逆转录、第一轮普i 鄱C R ) 对方法的灵敏度、准确性无明显影响。 6 、建立的A S P C R 方法对阴阳性对照样本具有良好的检测能力，K 1 0 3 N 、M 18 4 I 、 M 1 8 4 V 、T 2 1 5 F 和1 2 1 5 Y 的A C t I 盎界值分别为1 2 5 、8 0 、9 7 、1 6 和1 2 ，可以用于 对实际样本的检测。 第二部分A S PC R 力“ 法在检测H 1 微量耐药突变中的应用 利用建立的A S P C R 方法对临床样本进行了相应
12、耐药位点的检测。对7 6 份血 浆样本分别进行了K 1 0 3 N 、M 1 8 4 I M 1 8 4 V 、T 2 1 5 F T 2 1 5 Y 横断面检测，检测了1 0 例( 6 4 人份) 我国河南省某县最早接受抗病毒治疗( 治疗时间为2 0 0 3 年1 1 月) 病 2 硕士学位论文摘要 人的系列样本，绘制了相应的耐药位点的变化曲线，监测其耐药突变变化的情况， 并将A S P C R 检N 5 个耐药突变位点的结果与常规基因型耐药检测方法进行了比 较。主要结果如下： 1 1 4 0 份样本中，6 2 份存在K 1 0 3 N 、4 6 份存在T 2 1 5 F 、8 5 份存在T
13、 2 1 5 Y 、7 3 份存 在M 1 8 4 I 、8 9 份存在M 1 8 4 V 。A S P C R 方法检出的耐药突变中，大多数占病毒准 种的比例低于1 0 或高于5 0 ，其中一半以上耐药突变占病毒准种的比例低于 2 0 。 ， 2 与常规H I V - 1 基因型耐药检测方法相比，A S P C R 检测微量耐药突变的能力显 著提高。在5 个耐药突变位点中，除K 1 0 3 N 位点外。A S P C R 与常规基因型分析方 法的检测结果在统计学上存在显著差异( K 1 0 3 N ：3 3 6 、7 s3 7 1 ( P = o 5 3 2 0 ) ； M 1 8 4 V
14、- 1 7 1 v s6 3 6 ( p 1 0 0 0 0 c o p i e s m 1 ) 的样本中，微量( 占病毒准种的比例低于2 0 ) T 2 1 5 F Y 主要存在 于相对低病毒载量( 6 。 硕士学位论文第一部分 D - h # C t 山 I 恤 ： ； ：! ：i I 蝴 + I f f 突变型模扳扩增曲线 j 0 1 可 川 I 斗删糟4 I L _ 晶L I 嗍 ：t：j 1 歹￥饫? 恫四。 ，t 1 ! I ：! ，。| 。J ； 聃I 蜃 ； 币 i 呲Y ，| ! jI 删 j ； 。 、 ! ： l - l j 9 I 、 。矿 ， ：l 、 厂 、 i ；一 I - 幛 。“_ _ 叫 一 ： ： i i Il ，5 ，l 1 1 “ “ 1 5 1 1 1 7 1 1 I 柚甜扫嚣”篇篇耵矗一材霉一葛
