《ang2 mrna在急性髓系白血病患者骨髓细胞的表达及临床意义(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ang2 mrna在急性髓系白血病患者骨髓细胞的表达及临床意义(1)（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 A n 9 2m R N A 在急性髓系白血病患者骨髓细胞的表达 T h es t u d yo nt h ee x p r e s s i o no f A n 9 2g e n ea n di t sc l i n i c a l S i g n i f i c a n c e i na c u t em y e l o i dl e u k e m ic e l l s l g n l l l c a n c ea c udl e u k e m i ac e l l s 课题来源： 专业名称内科学( 血液病) 学位申请人 指导教师 答辩委员会
2、主席 答辩委员会成员 论文评阅人 2 0 10 年5 月2 8 日 广州 硕士学位论文 r l l ll l ii 1 I I i i i II r lIi iJ 17 7 0 0 01 A n 9 2m R N A 在急性髓系白血病患者骨髓细 胞的表达及临床意义 硕士研究生：刘理想 指导教师：孟凡义 摘要 背景与目的： 急性髓系白血病( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，A M L ) 是一种生物学和预后相差 显著的严重危害人类健康的常见造血系统恶性肿瘤。化疗一直是A M L 传统的治疗 手段，目前6 0 8 0 的A M L 患者经标准化疗后可以
3、获得完全缓解( c o m p l e t e r e m i s s i o n , C R ) ，但即使获得C R 后通过巩固治疗、定期强化和维持治疗，无病生存 率仍徘徊于4 0 一5 0 的低水平间，多数由于对抗白血病药物产生多药耐药而 使治疗失败。A M L 具有复杂的异质性，不同亚型A M L 的治疗方法不同，预后也有 很大差别。患者的年龄和遗传学改变是初诊A M L 的主要预后因素，大约5 5 的 A M L 都存在细胞遗传学的异常。此外高白细胞数、达缓解时间延迟、继发白血 病等被认为是白血病的不良预后因素。通过S N P 、基因芯片等技术已证实，许多 基因突变和基因表达异常与白血
4、病的预后相关，如具有C E B P A 、N P M l 基因突变 的A M L 预后较好，而w T l 突变、P 5 3 突变、M L L 突变和F L T 3 - - T K D 突变的A M L 预后 则较差。伴有S o r c i n 、E G R 、B A A L C 、M N l 等基因高表达的白血病预后也较差。 而M L L P T D 对A M L 预后无影响。因而根据细胞遗传学和分子遗传学诊断与预后 分析，采取靶向治疗和个体化治疗相结合的手段，将进一步提高白血病治疗效 果。 文献检索及生物信息学分析发现，血管生成素2 ( a n g i o p o i e t i n 2 ，
5、A n 9 2 ) 位于 8 p 2 1 ，相对分子质量约为7 5 1 0 3 ，全长4 9 6 个氨基酸，约6 0 与A n g l 相同，分 中文摘要 子结构也与A n g l 类似，均包括9 个外显子和8 个内含子。A n 醇是一个内皮特 异性生长因子，主要表达于血管重塑活跃的部位及血管高度增生的肿瘤组织，可 能是肿瘤血管生成的早期信号，其表达增多是肿瘤快速增长并易于发生转移的 一个早期标志。A n 9 2 基因在胃癌、乳腺癌、肝癌、血管瘤及胶质瘤中表达增高， 并与胃癌的进展密切相关。逆转录酶P C R ( R e v e r s et r a n s c r i p a s ep o
6、l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，R T P C R ) 方法分析A n 9 2 在C D 7 ( + ) A M L 高表达，而t ( 8 ；2 1 ) 的 A M L 低表达，经化疗达完全缓解后A n 9 2 水平表达降低，不易检测到。免疫组 化法分析证实A n 9 2 在A M L 患者骨髓中高表达，且在慢性粒细胞白血病( C h r o n i c m y e l o i dl e u k e m i a ，C M L ) 急变中A n 9 2 表达高于慢性期患者乜1 。M a r t i n e l l i 等1 测定早期的B 细胞慢
7、性淋巴细胞白血病( C h r o n i cl y m p h o c y t i cl e u k e m i a ， C L L ) A n 9 2 的表达，结果显示早期的B 细胞慢性淋巴细胞白血病A n 9 2 高表达与 I g V ( H ) 基因突变、骨髓血管增生相关。 鉴于A n 配基因在实体瘤中的表达与作用，以及在白血病中的初步研究结果， 本文通过实时荧光荧光定量P C R ( R r e a l t i m eq u a t i t a t i v eP C R ，R Q P C R ) 技术检 测A n 9 2 在A M L 中的表达，旨在探索A n 9 2 对A M L
8、的早期诊断、治疗及预后的影响 有无意义，在各类型中表达有无差异，能否作为治疗的靶点。 方法： 1 研究对象：所有白血病骨髓标本均取自临床表现、细胞形态学和免疫分 型及细胞遗传学特征确诊的患者，初治组9 8 例，复发组1 3 例，难治组1 0 例， 缓解组1 8 例，正常对照组为年龄、性别匹配的健康供者1 6 例。 2 引物设计与合成：根据G e n e B a n k 的序列设计A n 9 2 各基因及管家基因 p - a c t i n 引物。 3 提取白血病及健康供者骨髓单个核细胞，提取总R N A ，逆转录成e D N A ， 进行实时荧光定量P C R 。通过熔解曲线确定P C R 产
9、物的特异性。取两管平均C t 值计算2 - A c r 值，作为各标本m R N A 的相对表达量，AC T = ( 目的基因C T 值一内 参基因C T 值) 。比较A M L 初治组与正常对照组、初治组与缓解组、初治组与 硕士学位论文 复发组、初治组与难治组、复发组与正常对照组、难治组与正常对照组、复发 组与缓解组、难治组与缓解组、A M L 各亚型之间、各亚型与正常对照组之间A n 9 2 m R N A 表达水平有无统计学差异。以对照组表达水平中位数2 倍为界，将研究对 象分为高表达组与低表达组，比较初治组中首疗程C R 组与N R ( n oc o m p l e t e r e m
10、 i s s i o n ) 组、复发或进展为难治性白血病发生率、正常核型与预后不良核型组、 3 年内死亡病例组与3 年内仍存活病例组患者骨髓单个核细胞A n 醇m R N A 表达 水平差异，及高表达组和低表达组无病生存期和总生存期的差异。 4 应用S P S S l 3 0 统计软件分析数据，计量资料呈非正态分布，用中位数 描述；两组计量资料间分布比较用M a n n W h i t n e yU t e s t ；两变量间相关分析采用 S p e a r m a nr a n kc o r r e l a t i o na n a l y s 纽率的比较采用c h i - s q u a
11、 r et e s t ；生存分析用 K a p l a n - M e i e r 曲线：生存率比较用l o g - r a n k 检验；单因素分析及多因素分析用 C o xR e g r e s s i o n ；检验水准0 t = 0 0 5 ，双侧检验。 结果： 1 R N A 、e D N A 纯度和质量分析：所提取总R N A 、e D N A 经紫外分光光度计 检测，比值在1 8 , - - , 2 0 之间。 2 同一标本e D N A 经1 0 倍比稀释后，设6 个梯度，测各梯度浓度，范围是 8 1 2 5 8 8n g l x l ，分别对管家基因和目的基因进行扩增，6
12、个梯度的AC T 相 差很小，说明在浓度范围内管家基因与目的基因的扩增效率一致，其C T 值可以 反应扩增基因的丰度。扩增后进入熔解程序生成熔解曲线，熔解曲线显示锐利 的单一峰，无其它特异峰，说明扩增产物均一，无非特异扩增及引物二聚体。 琼脂糖凝胶电泳显示A n 9 2 基因所扩增片段条带单一，无引物二聚体和非特异性 扩增。 3 基因表达：A M L 初治组A n 9 2m R N A 表达水平显著高于缓解组、J 下常对照 组( Z = - 3 4 7 0 ，0 0 0 1 ；Z _ 一2 5 7 0 ，P = 0 、0 1 0 ) ；A M L 复发组A n 配m R N A 表达水平 显著
13、高于缓解组、正常对照组( Z = - 2 9 4 2 ，0 0 0 3 ；Z = - 2 1 4 2 ，P = 0 0 1 3 ) ；A M L 难治组A n 9 2m R N A 表达水平显著高于缓解组、j 下常对照组( z = 3 5 4 9 ，P = 0 0 0 0 ； I I I 中文摘要 Z 芦3 3 2 2 ，0 0 0 1 ) ：而初治组与复发组、难治组比较无统计学差异( Z = 一0 9 4 5 ， P = 0 3 4 5 ：Z = 1 5 3 7 ，P = 0 1 2 4 ) 。比较A M L 各亚型之间、各亚型与正常对照组、 缓解组之间A n 9 2m R N A 表达水平
14、显著高于差异( 共1 4 组，P = 0 0 0 3 5 为显著性差 异的较正后的P 值) 发现，A n e 2m R N A 在M 2 亚型显著高于缓解组，各亚型之间 比较无统计学差异。 4 基因表达水平与临床的关系：将A n 醇基因的表达水平与患者初诊时年 龄、血红蛋白、白细胞计数、血小板计数、乳酸脱氢酶水平和外周血白血病细 胞比例及骨简白血病细胞比例等指标做相关性分析，结果显示A n 9 2m R N A 表达 水平在男女患者之间无统计学差异( Z 一0 5 8 7 ，P = 0 5 5 7 ) 。A n e 2m R N A 表达水平 与患者初治时年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小
15、板计数、外周血原幼 稚细胞比例、骨髓原幼稚细胞比例均无显著性相关，相关系数绝对值均小于0 - 3 ， P 0 0 5 。 5 与疗效的关系：依据对照组A n e 2 m R N A 表达水平中位数的2 倍为界将患 者分成两组，高于对照组A n 9 2m R N A 表达水平中位数2 倍定义为高表达组，低于 对照组A n 9 2m R N A 表达水平中位数2 倍定义为低表达组。初治组9 8 例患者除去6 例治疗不足1 疗程即死亡和4 例入院后未治疗即自动出院未列入统计外，其余8 8 例均列入治疗反应分析。A n 9 2m R N A 高表达组5 7 例，经首疗程化疗达到完全缓解 ( C R )
16、 2 8 例( 4 9 1 ) ，未达C R ( 包括部分缓解和未缓解) 2 9 例( 5 0 9 ) ；低 表达3 l 例，C R 2 2 例( 7 0 9 ) ，未达C R 9 例( 2 9 1 ) 。X2 检验显示两组C R 率有 显著性差异( P 0 0 5 ) e x c e p tt h ea n e 2g e n ee x p r e s s i o nl e v e l W a sh i g h e ri nM 2t h a nr e m i s s i o ng r o u p 4 R e l a t i o n s h i pb e t w e e ng e n ee x p r e s s i o n l e v e la n dc l i n i c a li n d i c a t o r s ： C o r r e l a t i o na n a l y s i sW a sd o n eb e t w e e ne
