《ae3基因sirna表达质粒的构建及对其转染的心肌细胞h9c2的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ae3基因sirna表达质粒的构建及对其转染的心肌细胞h9c2的影响（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、南昌大学医学院 硕士学位论文 AE3基因siRNA表达质粒的构建及对其转染的心肌细胞H9c2的影 响 姓名：闻琴 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：何明 20080501 摘要 摘要 目的：利用R N A 干扰( R N A i ) 技术，以A E 3 为靶基因，设计构建s i R N A 表达质 粒，进行测序鉴定，并检测该表达质粒对大鼠心肌样细胞系H 9 c 2 A E 3 基因表达 的影响，为进一步研究A E 3 基因在心肌细胞损伤及保护中的作用奠定基础。 方法： 1 设计具有短发央结构的三条D N A 序列，经退火成互补双链，再克隆至载 体p S i l e n c e r 3
2、 1 一H 1 - h y g r o 中构建重组表达载体，转化D H 5Q 菌株，提取质粒并 进行序列测定。 2 转染携带绿色荧光蛋白的p E G F P N 2 质粒，荧光显微镜观察检测瞬时转染 不同时相的转染效率，选择最佳时相用于后续瞬时转染靶基因表达抑制率的分 析。 3 利用构建成功的s i R N A 表达质粒，通过脂质体介导转染H 9 c 2 心肌样细胞， 并通过R T - P C R 、W e s t e r nb l o t 检测细胞中A E 3m R N A 和蛋白的表达。 结果： 1 重组质粒转化D H 5Q 菌株经氨苄青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。 2 测序鉴定表明重
3、组质粒中含有针对A E 3 基因的目的序列。 3 将p E G F P N 2 通过脂质体介导，转染H 9 c 2 心肌样细胞，分别于转染2 4h 、 4 8h 、7 2h 后在荧光显微镜下观察转染效果，可见H 9 c 2 心肌样细胞胞浆内有绿 色荧光，其中转染4 8h 的转染效率8 2 6 显著高于转染2 4h 的转染效率4 3 6 ( P 0 0 5 ) ， 而H 9 c 2 s i - A E 3 A 细胞和H 9 c 2 s i - A E 3 - B 细胞A E 3 的表达量则明显降低口( 0 0 1 ) ， 相对积分吸光度值显示H 9 c , 2 s i - A E 3 - A 细
4、胞、H 9 c 2 一s i - A E 3 - B 细胞和 H 9 c 2 s I - A E 3 C 细胞A E 3 蛋白表达分别降低了6 1 、4 8 和2 5 ( F i g u r e 3 B ) 。 第3 章结果 H 9 c 2H 9 c 2 - s i - G A P D H t B a c t i n ( 4 3K D ) _ 飞A P D H ( 4 0K D ) F i g u r e3 7C h a n g e s i n G A P D H m D t e i ne x p r e g i o no f H 9 2 m m s f e c m t w i t h p s
5、 i l e n c e r 3 1 H I o h M g r o - s i R N A ( F 5 ，o * - S D ) - P 哪0 1 ”H 9 t 2 t i 1 i0 8 o 。0 6 三 曼o4 ；0 2 E 0 雷 12345 哆，名一 F i g u r e3 8C l g e si nA E 3p r o t e i ne x p r i o no f H 9 c 2m m s f e c t e dw i t hp S i l e n c e r 3 I - H I - b y o - s i R N A ( I F 5 ，X S D ) 0 l ，b P 哪0 5
6、v sH 9 c 2 ；。咖0 5 H g c 2 - s i - A E 3 - C L a n el ：H 9 l c 2 ； L m 2 ：H g c 2 - N C ；L a n e3 ：H g c 2 - s i - A E 3 - A ；L a n e 4 ：H g c 2 - s i A E 3 - B ：L a n e5 ：H g c 2 - s i o A F 3 - C 第4 章讨论 第四章讨论 4 1A E 3 蛋白的结构、分布及功能 A E 3 蛋白是一种多功能嵌膜蛋白，分为两个区域，亲水性的N 端胞质域( 约 7 0 0 个氨基酸残基) 和疏水性的C 端跨膜域( 大约
7、5 0 0 个氨基酸残基) ，C 端跨 膜区域包括膜外侧区和穿膜区，其基因家族成员所表达的C 端膜区( 疏水区) 结构呈高度相似，而N 端胞浆区的氨基酸序列差异很大，这主要是各亚型的转 录启动子不同【1 3 , 1 4 】。根据N 端氨基酸序列的不同，A E 3 有两个不同的亚型，即 b A E 3 和c A E 3 1 1 4 l 。b A E 3 和c A E 3 还各有相对应的缺少跨膜域序列的变异体， b A E 3 1 4 n t 和c A E 3 1 4 n t ，但其功能还不甚清划1 5 J 。 A E 3 最早于1 9 8 9 年由K o p i t o 等I l6 J 克隆，主
8、要分布在可兴奋组织，包括大脑 1 6 , 1 7 1 、，t l , 脏【1 8 , 1 9 】、视网膜【2 0 】和平滑肌细胞，但在肠上皮细胞、肾脏等也有分 布【1 9 , 2 2 。b A E 3 ，又称为全长A E 3 ，主要存在于大脑中【1 6 l 。在一t L , 脏中，c A E 3 的 表达丰度最古【矧，但也有b A E 3 的表达。在肾脏上皮细胞的基底面、肠上皮细胞 的基底面及游离面都检测到了b A E 3 ，相比而言，c A E 3 只存在于这两种上皮细 胞的游离面【1 9 】。b A E 3 和c A E 3 在视网膜的表达水平大致相似，只是分别分布在 视网膜的不同细胞层I
9、 删。 作为心肌细胞内C l 浓度的主要调节因素之一，A E 3 蛋白具有非N a + 依赖的 C I - H C 0 3 “ 交换功能，泵出H C 0 3 ，同时泵入C l ，使细胞P q 酸化1 2 4 1 。激活此离子 交换系统，一方面，使细胞内C l 一浓度增加，另一方面，可使细胞内p H ( p H i ) 发 生改变陋2 6 1 。A E 3 蛋白在调节细胞酸碱平衡，维持细胞内稳定的p H 值，调节细 胞体积及细胞内C l 。的浓度中起重要作用l z 。 近年来有研究表明，细胞内C l 浓度增加，1 1 0 C r 过载是引起心肌缺血再灌注 损伤的一个重要机制【1 0 l 。在离体
10、大鼠心肌细胞中，在缺氧复氧的刺激下，细胞 内的A E 3m R N A 和蛋白的表达都有改变，其中使用a 用C 0 3 。通道的阻断剂D I D S 能大大的降低了心肌细胞的缺氧复氧造成的损伤【2 8 】。但由于该阻断剂缺乏特异 性、高亲和力，因此对于A E 3 蛋白是否介导C l 过载从而参与- t l , 肌缺血再灌注损 伤目前仍不完全清楚。本实验利用R N A 干扰技术，通过降低A E 3 基因的表达，为 第4 章讨论 进一步探讨A E 3 的功能及调节机制奠定基础。 4 2R N 干扰技术 R N A i 由短双链R N A 分子抑制相应序列m R N A 表达或使其沉默的过程，它 广
11、泛存在生物界中，是一种典型的转录后基因调控方式。研究表明，s i R N A 较 单链反义D N A 、反义R N A 有更高效的抑制效果I 捌。 在R N A i 研究中，序列的设计是至关重要的一环。设计的原则主要依据以下 几点：第一点是从靶基因起始密码子A U G 下游5 0 1 0 0 b p 开始搜寻理想的s i R N A 序列，越靠近靶基因的3 端，其基因沉默效果可能越好【3 0 】，搜寻A A 序列并记录 每个A A3 端相邻的1 9 个核苷酸作为候选的s i R N A 靶位点；第二点要求G C L t , 在 3 5 “ - 6 0 之间，应避免选取高G 含量或连续的G 区段
12、，因为它们趋向形成G 四聚 体结构；第三点是靶序列不能有连续4 个A 或T ，否则可能终止由R N AP o l y m e r a s e I 介导的转录1 3 u ；第四点要将得到的靶序列进行B L A S T 分析，确保该s i R N A 只 针对靶基因。第五点是设定适当的对照。 所有的R N A i 试验均应设立阴性对照，s i R N A 阴性对照序列的合理设计与 s i R N A 序列的设计同样重要。阴性对照s i R N A 包括碱基错配或混乱序列的 s i R N A 。来源于s i R N A 序列的混乱序列s i 砌妊，在s i R N A 实验中是一个阴性对 照，不能
13、引起相应的基因沉默，从而作为一个信息控制可反映R N A i 的特异性。 混乱序列s i R N A 与s i R N A 序列相比具有相同的核苷酸组成，但是核苷酸顺序被 打乱，同样要保证它和靶m R N A 没有同源性。本实验还设定了针对G A P D H 的 s i R N A 序列作为阳性对照，通过降低内源性基因G A P D H 的表达，可以充分证明 s i R N A 能对靶基因产生特异性基因沉默，从而增强实验的可信度。 目前，针对高效特异靶序列的设计，许多公司已有了设计靶序列的软件。 而对于干扰片段s i R N A 的合成，实验室主要有五种方法1 3 2 1 ： 第一种是最经典的
14、方法即化学合成法，根据设计好的靶序列，直接在体外 化学合成R N A ，而后退火成双链，这种方法具有简单、快速、易转染等优点； 但R N A 极不稳定易降解，且化学合成代价昂贵，只能进行瞬时转染而不能在细 胞内稳定表达。 第二种方法是体外转录法，设计特定的寡核苷酸序列，通过R N A 聚合酶分 别在体外转录出正义和反义R N A ，再将两者退火，形成d s R N A ，易转染入细胞 第4 章讨论 内，不足之处和第一种方法相似。 第三种方法是以含T 7 启动子的D N A 为模板体外转录出d s R N A ，然后用 R n a s e l I I 家簇的D i c e r 酶将d s R N
15、 A 切割成大量的s i R N A ，这种方法不需要筛选最 佳s i R N A 靶序列，且相对易转染，价格也经济；但是有可能会引发非特异的基 因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因，也不宜用于长期的干扰研究，不 能用抗生素筛选转染成功的细胞。 第四种方法是以质粒、病毒载体介导的s i R N A 体内表达法，质粒、病毒上 带有抗性基因可用于筛选转染后的细胞；在外源序列插入处前含有H l 或U 6 启 动子，这种启动子在转染细胞后能自动转录出干扰片段，外源序列插入处后含 有连续6 个T ，能终止转录；干扰片段也是通过化学合成得到，两条D N A 单链 经退火生成两端为不同酶切位点( 与质粒、
16、病毒酶切位点相对应) d s R N A ；将干扰 片段构建入质粒或病毒载体后，通过脂质体等试剂转染入细胞后，以干扰片段 的反义链为模板转录生成s h R N A ，经过进一步加工成s i R N A ，发挥R N A i 效用； 利用质粒或病毒上带有的抗性基因，可筛选细胞建立稳定表达的细胞系，进行 长期的基因功能研究【3 3 】；这种方法费用适中，克服了以上三种方法的缺点；不 足之处是质粒或病毒片段较大，转染效率较低：目前R N A i 多采用这种方法。 第五种方法是s i R N A 表达框架( s i R N Ae x p r e s s i o nc a s s e t t e s ，S E C s ) ，它包含 R N A p o l y l I I 启动子，编码s h R N A ，R N Ap o l y l I I 终止子，是一种由P C R 得到的 s i R N A 表达模板。在P C
