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1、实验一 真核细胞染色体DNA的 分离、纯化和检测,实 验 目 的,通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。 学习琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。,红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞 用蛋白酶K水解蛋白质 有机溶剂酚、氯仿抽提 在高盐条件下,用乙醇沉淀DNA 再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA,实 验 原 理,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定,后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移
2、动,在用电泳法测定DNA分子大小时,应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应,使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定,提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压,也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。,实 验 原 理,纯净的DNA A260/A280=1.8,制备的DNA样品应该为1.71.8 纯净的RNA A260/A280=2.0,制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A2802,说明样品中RNA过高,可用RNase消化后,用酚、氯仿、异戊醇抽提,再用乙醇沉淀DNA; 如果样品A260/A280为1.82.0,说明样品中盐的含量过高,
3、样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。,实 验 原 理,实 验 材 料,红细胞裂解液 KHCO3 1g (10mM) NH4Cl 8.3g (155mM) EDTANa2 37mg (0.1mM) 裂解缓冲液(lysis buffer) 10mM Tris-Cl (pH8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 0.5%(m/v) SDS ACD抗凝液 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml ACD液 组织细胞 动物血
4、液样品,将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀,0下保存数天或-70下长期冻存,备用。,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 70%乙醇 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统,实 验 材 料,染色体DNA的制备方法,1. 取800l抗凝血液置于5ml离心管中。 2. 往管中加3ml红细胞裂解液,轻摇数次,置冰上5分钟,期间间歇摇动 几次。 3. 4000rpm,室温离心5分钟,弃上清。 4. 往管中加入3ml红细胞裂解液,重悬沉淀,冰上5分钟,期间摇几次。 5. 4000rpm,离心5分钟,弃上清。 6. 重复步骤4、5四至五遍,至出现明显白色沉淀。 7. 用
5、1PBS重悬白色沉淀。 8. 4000rpm,离心5分钟,弃上清。 9. 每管中加入500l白细胞裂解缓冲液(每小组配制1ml),重悬细胞,加入 20l proteinase K(20mg/ml),混匀后转移至1.5ml离心管,置55水浴 1小时。,10. 加入酚:氯仿500l,盖紧后上下颠倒几次10000rpm,离心5分钟,取上层水相,至1.5ml离心管,加入氯仿500l,盖紧后上下颠倒几次10000rpm,离心5分钟,取上层水相至5ml离心管。 (两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm) 11. 加入1ml无水乙醇,可见混浊,盖紧后上下颠倒混匀可见DNA凝集成絮状,溶液又变澄清。 12. 1
6、2000rpm,离心2分钟,弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm,离心2分钟,弃上清。 14. 开盖室温干燥沉淀2分钟。 15. 加入50l DDW(无菌水)55水浴5分钟溶解DNA,取10l电泳。 16. 加入3ml DDW至剩余样品中,室温混合2分钟,测OD260和0D280,计算DNA浓度及OD260/0D280。,染色体DNA的制备方法,琼脂糖凝胶电泳方 法,1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平,检查稳压电源与正负极的线路。 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端,防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳,垂直架在电泳板
7、负极的一端,使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。 3. 制备琼脂糖凝胶:按照被分离DNA分子的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖,溶解在电泳缓冲液中,大电泳槽约160毫升,小电泳槽约35毫升凝胶液,置微波炉或水浴锅中加热,至琼脂糖全部溶化。 4.待凝胶溶液冷至50左右时,在凝胶溶液中加入EB(终浓度0.5g/ml),摇匀,轻轻倒入电泳板上,除去气泡。,5待凝胶冷却凝固后(约30分钟),在电泳槽内加入电泳缓冲液,大电泳槽约需1200ml,小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板,放入电泳槽,然后小心取出点样梳,保持点样孔的完好,去除空内气泡。 6待测的DNA样品中,加五
8、分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液(6loading Buffer)。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释,再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10l样品与2l溴酚蓝指示剂点样缓冲液,混匀后小心地进行点样,记录点样顺序和点样量。 7打开电源,DNA的迁移速度与电压成正比,与琼脂糖含量有关。最高电压不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V,小电泳槽不超过150V)。 8电泳时间看实验的具体要求而定,在电泳途中可用紫外灯直接观察,DNA各条条带分开后,可以结束电泳。一般20分钟2小时,取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。,琼脂糖凝胶电泳方 法,DNA样品的纯化和定量检测方法,1
9、取DNA粗制样品,加入RNase至终浓度10g/l,37 反应0.5小时。 2加入酚:氯仿:异戊醇(25:4:1)等体积抽提13次,12000 rpm,离心5分钟,取上清。 3加入1/10倍体积3M NaAc(pH5.2),2倍体积无水乙醇混匀,室温下3060min。 415000 rpm,离心10分钟。 5DNA沉淀用冰预冷70 %乙醇洗1次,开盖37 干燥10min(使乙醇挥发)。 6加入30l TE buffer,37 水浴至沉淀溶解。 7取10 l DNA 1 %琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统记录和分析结果,估计样品DNA分子量。 8取10 l DNA母液稀释至1000ul,在紫外分光光
10、度计上测A260和A280。计算样品DNA浓度,判断样品浓度和DNA纯度。,电泳注意事项,1. 琼脂糖的质量: 琼脂糖(agarose)是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质,这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响,因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联,因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性,不含有带电荷的基因,不引起DNA变性,又不吸附被分离的
11、物质,因此它是一种很好的凝胶剂。,2. DNA分子的迁移率: 影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的,除了决定于DNA分子大小与构型外,还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小,采用一下措施: (1) 每次测定时,要有已知分子量的DNA片段作为标准, 进行对照。电泳。 (2) 选择最合适的电泳条件。 (3) 提高分子筛效应,降低电荷效应。,电泳注意事项,3. EB染色:EB是核酸的显色剂,使用EB对DNA染色的3种方法: (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。 (2) 只在胶中加入EB,在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污染
12、的可能。 (3) 在电泳结束后,取出凝胶,放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。 4溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用:含有50%蔗糖,可增加上样DNA溶液的密度,以确保DNA样品沉入点样孔内,起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300400bp双链线状DNA。 5点样量太高易产生拖尾与弥散现象,样品迁移速度减慢。点样量太少,分辨不清,影响结果。 6EB为强诱变剂,剧毒,操作时要带一次性手套,并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来,让有EB的面朝里,有EB的废液和器皿不能随便丢弃,要用专门方法处理后丢弃。,电泳注意事项,DNA定量检测注意事项,测定光吸收值时,用稀释DNA样品的溶液做对照。 选择稀释要适当,应在检测范围之内。,思 考 题,实验中影响染色体DNA完整的因素有哪些?如何减少这些因素对完整性的影响? 如何判断提取的染色体DNA样品的质量? 为了获得清晰的DNA样品电泳图,在琼脂糖凝胶电泳过程中应该注意哪些问题? 如何选择测量DNA的合适的稀释倍数? 为什么需要对DNA进行纯化?,