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1、实验一 真核细胞染色体DNA的 分离、纯化和检测,实 验 目 的,通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。 学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。,红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞 用蛋白酶K水解蛋白质 有机溶剂酚、氯仿抽提 在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA 再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA,实 验 原 理,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移
2、动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。,实 验 原 理,纯净的DNA A260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.71.8 纯净的RNA A260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A2802，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； 如果样品A260/A280为1.82.0，说明样品中盐的含量过高，
3、样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。,实 验 原 理,实 验 材 料,红细胞裂解液 KHCO3 1g (10mM) NH4Cl 8.3g (155mM) EDTANa2 37mg (0.1mM) 裂解缓冲液（lysis buffer） 10mM Tris-Cl (pH8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 0.5%(m/v) SDS ACD抗凝液 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml ACD液 组织细胞 动物血
4、液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0下保存数天或-70下长期冻存，备用。,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 70%乙醇 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统,实 验 材 料,染色体DNA的制备方法,1. 取800l抗凝血液置于5ml离心管中。 2. 往管中加3ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上5分钟，期间间歇摇动 几次。 3. 4000rpm，室温离心5分钟，弃上清。 4. 往管中加入3ml红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上5分钟，期间摇几次。 5. 4000rpm，离心5分钟，弃上清。 6. 重复步骤4、5四至五遍，至出现明显白色沉淀。 7. 用
5、1PBS重悬白色沉淀。 8. 4000rpm，离心5分钟，弃上清。 9. 每管中加入500l白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)，重悬细胞，加入 20l proteinase K（20mg/ml），混匀后转移至1.5ml离心管，置55水浴 1小时。,10. 加入酚：氯仿500l，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相，至1.5ml离心管，加入氯仿500l，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相至5ml离心管。 （两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm) 11. 加入1ml无水乙醇,可见混浊，盖紧后上下颠倒混匀可见DNA凝集成絮状，溶液又变澄清。 12. 1
6、2000rpm，离心2分钟，弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm，离心2分钟，弃上清。 14. 开盖室温干燥沉淀2分钟。 15. 加入50l DDW（无菌水）55水浴5分钟溶解DNA,取10l电泳。 16. 加入3ml DDW至剩余样品中，室温混合2分钟，测OD260和0D280，计算DNA浓度及OD260/0D280。,染色体DNA的制备方法,琼脂糖凝胶电泳方 法,1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板
7、负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。 3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。 4.待凝胶溶液冷至50左右时，在凝胶溶液中加入EB（终浓度0.5g/ml），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。,5待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。 6待测的DNA样品中，加五
8、分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（6loading Buffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10l样品与2l溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。 7打开电源，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V)。 8电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA各条条带分开后，可以结束电泳。一般20分钟2小时，取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。,琼脂糖凝胶电泳方 法,DNA样品的纯化和定量检测方法,1
9、取DNA粗制样品，加入RNase至终浓度10g/l，37 反应0.5小时。 2加入酚：氯仿：异戊醇（25：4：1）等体积抽提13次，12000 rpm，离心5分钟,取上清。 3加入1/10倍体积3M NaAc（pH5.2），2倍体积无水乙醇混匀，室温下3060min。 415000 rpm，离心10分钟。 5DNA沉淀用冰预冷70 %乙醇洗1次，开盖37 干燥10min（使乙醇挥发）。 6加入30l TE buffer，37 水浴至沉淀溶解。 7取10 l DNA 1 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估计样品DNA分子量。 8取10 l DNA母液稀释至1000ul，在紫外分光光
10、度计上测A260和A280。计算样品DNA浓度，判断样品浓度和DNA纯度。,电泳注意事项,1. 琼脂糖的质量： 琼脂糖（agarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起DNA变性，又不吸附被分离的
11、物质，因此它是一种很好的凝胶剂。,2. DNA分子的迁移率： 影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施： (1) 每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准， 进行对照。电泳。 (2) 选择最合适的电泳条件。 (3) 提高分子筛效应，降低电荷效应。,电泳注意事项,3. EB染色：EB是核酸的显色剂，使用EB对DNA染色的3种方法： (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。 (2) 只在胶中加入EB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污染
12、的可能。 (3) 在电泳结束后，取出凝胶，放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。 4溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有50%蔗糖，可增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点样孔内，起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300400bp双链线状DNA。 5点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。 6EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有EB的面朝里，有EB的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。,电泳注意事项,DNA定量检测注意事项,测定光吸收值时，用稀释DNA样品的溶液做对照。 选择稀释要适当，应在检测范围之内。,思 考 题,实验中影响染色体DNA完整的因素有哪些？如何减少这些因素对完整性的影响？ 如何判断提取的染色体DNA样品的质量？ 为了获得清晰的DNA样品电泳图，在琼脂糖凝胶电泳过程中应该注意哪些问题？ 如何选择测量DNA的合适的稀释倍数？ 为什么需要对DNA进行纯化？,
