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1、1,亚细胞蛋白质组学,基础医学院 病理生理学教研室 刘 芸,2,授课提纲,第一节 概论 第二节 细胞膜的蛋白质组学研究进展 第三节 高尔基体蛋白质组学研究进展 第四节 核孔复合体蛋白质组学研究进展 第五节 核仁蛋白质组学研究进展 第六节 线粒体蛋白质组学研究进展 第七节 展望,3,第一节 概论,真核生物体是一个复杂系统。,蛋白质的亚细胞定位对蛋白质生物功能的发挥起到极关键的作用,蛋白质亚细胞定位信息强烈暗示着其生物学功能。,亚细胞蛋白组学已日益成为蛋白质组学研究的焦点之一。 Rabilloud T, Kieffer S, Procaccio V et al. Electrophoresis,
2、1998, 19: 1006-14.,以人为例,基因组分析表明,人具有3万5万个基因,经过剪切和翻译后修饰产生更多的蛋白质种类;受蛋白质等电点极限、疏水性、相对分子质量范围以及蛋白质丰度限制,很难由2-DE技术一步到位地获得生物体的全蛋白质组。,4,一、亚细胞蛋白质组学的内涵,亚细胞蛋白质组学(subcellular prote- omics):针对细胞内不同区域结构功能单位的蛋白质组学研究。,5,一、亚细胞蛋白质组学的内涵,细胞器(organelle)或细胞区域 如细胞膜 (cell membrane)、细胞浆 (cytoplasm )、线粒体(mitochondria )、溶酶体 (lys
3、osome)、过氧化物酶体 (peroxisome)、内质网 (endoplasmic reticulum)、高尔基体 (golgiosome)和细胞核 (cell nucleus)等。,6,大分子结构体 (macromolecular structure)或多蛋白质复合体 (multiprotein complex) 如核基质 (nuclear matrix)、剪接体 (spliceosome )、纺锤体 (spindle pole)、核孔结构 (nuclear pore complex)以及核糖体(ribosome)等。,一、亚细胞蛋白质组学的内涵,7,富集低丰度蛋白质,完善全细胞蛋白质组
4、 提供蛋白质的亚细胞定位信息 加深对亚细胞组分的结构功能理解 加深对细胞生理分子机制的理解 利于亚细胞蛋白质组的差异表达谱研究,二、亚细胞蛋白质组学的意义,8,三、亚细胞蛋白质组学的技术基础,亚细胞组分的分离纯化 蛋白质组学技术研究,9,(一)亚细胞组分的分离,10,1、细胞的破碎:渗透压冲击、超声波震荡、机械力研磨或剪切,(一)亚细胞组分的分离,2、亚细胞组分的分步分离 差速离心 与密度梯度离心 联用,11,差速离心 (differential centrifugation),是利用样品中各种组分的沉降系数不同而进行分离的方法,又称差分离心或差级离心。通常两个组分的沉降系数差在10倍以上时可
5、以用此法分离。,12,优点:样品处理量较大,可用于大量样品的初级分离。,缺点:分离复杂样品和要求分离纯度要求较高时,离心次数太多,操作繁杂。,13,差速离心形成的沉淀(肝脏),例,注:RCF即相对离心力。,14,细胞器的大小和沉降特性,* 核膜的制备物是否是完整的包膜,它的沉降速率取决于制备的方式。,15,密度梯度离心 (isodensity centrifugation),又称为区带离心,是将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中,离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。按照离心分离原理,梯度离心又可分为速率区带离心法 (又称连续密度梯度离心法)和等密度离心法 (又称不连续密度梯度
6、离心法)。,16,速率区带离心法是根据样品中不同组分粒子所具有的不同体积尺寸大小和不同沉降系数进行分离。,等密度区带离心法是根据样品组分的密度差别进行分离纯化。,17,密度梯度离心介质,蔗糖梯度,便宜,溶解度高,能够制备分离绝大多数成分所要求的密度范围的溶液,最常用;,高浓度时黏性大,且渗透压高。,Ficoll,Nycodenz,Percoll,Metrizoate,18,亚细胞成分在蔗糖和低渗透压介质中的密度,注:n.a. 为未得到数据; * 这些数据是在Nycodenz、 Metrizoate或Percoll中的密度。,19,3、免疫共沉淀法 (Co-IP) 分离信号复合体 (Signal
7、ing complex ),(一)亚细胞组分的分离,20,基本原理:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。,21,实验设计思路,22,(一)亚细胞组分的分离,4、亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分,根据细胞或亚细胞组分中不同种类的翻译后修饰特性可望用来分离各类被修饰的蛋白质。,23,(一)亚细胞组分的分离,5、分离纯化效果的评价,判断亚细胞分离纯化是否成功,可以用光学或电子显微镜监测,或者检测蛋白质浓度或合适的标志酶。,纯化过程中跟踪合适的标志酶的活性可以确定目的细胞
8、器的产率和污染其他细胞器成分的程度。,通过在纯化过程中确定蛋白质的浓度,计算每一步的比活性(活性与蛋白质的比率),可以用来估算富集程度或纯化倍数。,24,哺乳动物细胞膜的主要酶分布特点,25,(二)蛋白质组学技术,蛋白质分离技术与蛋白质鉴定技术的结合,26,(三)蛋白质亚细胞定位实验技术,endoG-YFP (apoptotic endonuclease),Mitochondria,Co-localization,为了验证亚细胞蛋白质组学的研究结果,如新发现蛋白质的亚细胞定位及其在亚细胞结构中的可能功能,需要细胞或分子生物学的补充实验予以证实。,Western blot TAP (tandem
9、 affinity purification) 电镜技术 荧光显微镜技术,27,(四)蛋白质亚细胞定位预测技术,亚细胞定位预测主要基于蛋白质氨基酸序列的三个方面的特性:氨基酸组成特点、分拣信号的识别以及氨基酸序列的进化保守性。,蛋白质在胞浆合成后,须在N端分拣信号 (sorting signal) 的指引下到达不同亚细胞部位发挥生物学功能。常用于蛋白质亚细胞预测的各种分拣信号包括:信号肽 (signal peptide, SP)、线粒体引导肽 (mitochondrial targeting peptide, MTP)、叶绿体运输肽 (chloroplast transit peptide,
10、CTP) 和核定位信号 (nuclear localization signals, NLS)。,28,互联网上常用的亚细胞定位预测软件,注:CTP 叶绿体运输肽 (chloroplast transit peptide) ; NLS 核定位信号 (nuclear localization signals); MTP 线粒体引导肽 (mitochondrial targeting peptide); SP 信号肽 (signal peptide)。,29,亚细胞定位预测的方法的建立包括四个步骤:,(四)蛋白质亚细胞定位预测技术,1. 建立客观、有代表性的各种已知亚细胞定位的训练用蛋白质数据系列
11、 (training dataset);,2. 从蛋白数据系列中抽提出各种特征信息参数;,3. 根据特征信息参数采用一些算法建立算法模型以计算比较可疑蛋白质某种亚细胞定位的可能性,4. 采用检验用蛋白质数据系列 (testing dataset) 结合不同评价方法对所建立算法模型的预测结果进行评价。,30,四、亚细胞蛋白质组学研究进展,1. 细胞器的蛋白质组学研究,2. 大分子结构体和多蛋白复合体的蛋白质组学研究,3. 模式生物的亚细胞蛋白质组学研究,4. 将定量技术和差异分析引入亚细胞蛋白质组学,31,第二节 细胞膜的蛋白质组学研究进展,一、细胞膜的结构与功能,真核生物中,细胞质膜 (pla
12、sma membrane) 与细胞内膜统称为生物膜 (biomembrane)。,与细胞起源、细胞分裂分化、细胞识别、免疫、物质运输、信息传递、代谢调控、能量转换、神经传导以及肿瘤的发生均有关。,32,一、细胞膜的结构与功能,蛋白质(包括酶),脂类,糖类(糖脂和糖蛋白),50%,40%,10%,33,二、膜蛋白质的特点,根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式,膜蛋白可分为两大基本类型:,外在膜蛋白 (extrinsic membrane proteins) 或 外周膜蛋白 (peripheral membrane proetins),内在膜蛋白 (intrinsic membrane pr
13、oteins) 或 整合膜蛋白 (integral membrane proetins),水溶性,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以分离,结构不被破坏。,双型性,以不同程度嵌入脂双层内不,疏水区域与脂双层中脂类分子的疏水尾部作用,亲水区域暴露在膜的一侧或两侧表面。,不易分离,只有用去垢剂才可分离,但分离后易失去正常构型。,34,三、膜蛋白质的双向凝胶电泳技术研究,细胞质膜负责细胞内外环境物质和信息的交流,在受体介导的信号跨膜传导、物质的转运等方面发挥重要作用。,细胞质膜是广泛的药物设计靶标,细胞质膜蛋白占整个已知药物靶标的70。所以,用
14、蛋白质组学方法分析细胞质膜蛋白质倍受关注。,35,三、膜蛋白质的双向凝胶电泳技术研究,膜蛋白的不易分离和疏水特性对传统的蛋白质组学技术尤其是双向凝胶电泳技术提出了严峻挑战。,各种新的破膜剂、表面活性剂、还原剂的使用 如: 硫脲与尿素的联用; -硫代型两性离子表面活性剂如CHAPS ; TBP (tributylphosphine) 代替常规还原剂二巯基乙醇DTT。,新的抽提方案出现,如:膜蛋白组分的分级抽提、采用双向变性剂Triton X-144 或进行Na2CO3预处理膜蛋白组分,分离内在膜蛋白以及采用有机溶剂抽提膜蛋白等。,36,四、膜蛋白质的非双向电泳技术研究,单向SDS-PAGE直接与
15、质谱技术结合分离鉴定膜蛋白混合物,已成为一种趋势,可避免采用固化pH梯度进行等电聚焦过程造成的膜蛋白质的丢失。,用于直接分析大蛋白复合体 (direct analysis of large protein complexes, DALPC) 的多维色谱与串联质谱联用的2D-LC-MS/MS技术,避免了双向电泳技术分离中等电点极限、疏水性、相对分子质量范围等因素的限制。,37,第三节 高尔基体蛋白质组学研究进展,一、高尔基体的结构与功能,高尔基体 (Golgi body) 又称高尔基器 (Golgi appa-ratus) 或高尔基复合体 (Golgi complex),是真核细胞内的一种重要细
16、胞器。,高尔基体是由大小不一、形态多变的囊泡体系组成,在不同的细胞中,甚至细胞生长的不同阶段都有很大的区别。有时不易辨认,而且更难分离与纯化,再加上一般动物细胞中数目较少,在含量丰富的肝细胞中也仅有50个左右的高尔基体。因此对高尔基体的结构与功能的研究,一直是细胞生物学家面临的挑战性难题之一。,38,一、高尔基体的结构与功能,电子显微镜所观察到的高尔基体最富有特征的结构是由一些(常常48个)排列较为整齐的扁平膜囊(saccules)堆叠在一起,构成了高尔基体的主体结构,扁囊多呈弓形,也有的呈半球形或球形。膜囊周围又有大量的大小不等的囊泡结构。,高尔基体是一种有极性的细胞器,靠近细胞核的一面,扁囊弯曲成凸面又称形成面 (forming face) 或顺面 (cis face),面向细胞质膜的一面常呈凹面 (concave) 又称成熟面 (mature face) 或反面 (trans face)。,39,一、高尔基体的结构与功能,高尔基体是细胞内大分子运输的一个主要交通枢纽,主要参与了细胞的分泌活动,是糖类合成和蛋白质翻译后修饰的重要场所。,