《抗弓形虫单克隆抗体的制备及夹心elisa方法的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗弓形虫单克隆抗体的制备及夹心elisa方法的建立（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、河南农业大学 硕士学位论文 抗弓形虫单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立 姓名：段张秀 申请学位级别：硕士 专业：预防兽医学 指导教师：宁长申;张龙现 20090601 河南农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 捅要 为建立弓形虫病标准、准确、快速的免疫诊断体系及亚单位疫苗的研制，为弓形虫抗原 的分离和纯化及探索弓形虫的保护性免疫等研究提供适宜的工具，本研究利用经淋巴细胞分 离液密度梯度离心、微孔滤膜过滤、多次低速离心提纯的弓形虫速殖子，再通过反复冻融和 超声波处理后作为抗原免疫B a l b c 小鼠6 次，获得针对弓形虫速殖子的抗体。间接E L I S A 检测结果显示，6
2、免后抗体效价均达到1 ：“0 0 以上。 本次建立的间接E L I S A 方法，其主要条件如下：0 5 9 9 m L 一的弓形虫速殖子为包被抗原， 1 牛血清白蛋白为封闭剂，l ：5 0 0 0 稀释H R P 标记羊抗鼠l g C 作为二抗，T M B ( 3 ，3 ，5 ， 5 四甲基联苯) 作为底物。实验证明，该方法特异性强，有较好的重复性。用该法对弓形虫 速殖子免疫小鼠的血清抗体及其杂交瘤细胞单抗上清进行检测，获得满意的效果。 以P E G 2 0 0 0 为促融剂，取效价高的免疫小鼠脾细胞与N S O 骨髓瘤细胞融合。经间接 E L I S A 方法筛选阳性孔，有限稀释法进行3
3、- - - 4 次克隆和亚克隆，获得4 株能稳定分泌抗弓 形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株( 3 A 3 、3 G 3 、4 F 4 、4 G 3 ) ，l 株单抗腹水( 3 A 3 ) 。经鉴定，4 株杂交瘤细胞株的上清效价分别在l ：8 0 0 1 2 8 0 0 之间，l 株腹水( 3 A 3 ) 效价在l ：5 1 2 0 0 ， 且稳定性良好，单抗亚类为I g G l ，与猪等孢子球虫、猪隐孢子虫、猪旋毛虫、猪蛔虫等无 特异性。采用免疫荧光法对腹水进行初步鉴定，发现均为抗速殖子单抗。单抗的腹水提纯后 进行S D S P A G E 和W e s t c n b l o u i n g 分
4、析，单抗的分子量均约为4 5 k D a 。用3 A 3 A 5 单抗包板 酶标板与猪抗弓形虫抗体建立夹心E L I S A 方法，单抗的最佳稀释度为l ：8 0 0 ，猪抗弓形虫 高免血清的最佳稀释度为l ：1 0 0 2 0 0 。特异性试验表明：该方法对于同属于孢子虫属的猪 等孢子球虫、猪隐孢子虫、猪旋毛虫、猪蛔虫有较高的识别力，其O D 4 s o n 。值则显著偏低。 该方法不受其它外界因素的影响，灵敏度高，特异性强，对于临床诊断和公共卫生学将是一 种简便、可靠的检测方法，为下一步建立弓形虫病快速诊断体系奠定了基础。 关键词：弓形虫：单克隆抗体；杂交瘤；夹心E L I S A 第1
5、页共6 4 页 河南农业人学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 R e s e a r c ho fM o n o c l o n a lA n t i b o d i e sA g a i n s tT o x o p l a s m ag o n d i iR H a n dD e v e l o p m e n to fS a n d w i c hE L I S ；A S u p e r v i s o r ：P r o f N i n gC h a n g s h e n ， P r o f Z h a n gL o n g x i a n M a s t e rC a n d i
6、 d a t e ：D u a nZ h a n g x i u A B S T R A C ：T l l ea i mo fm yr e s e a r c hi st ol a yf o u n d a t i o n sf o rd i a g n o s i sa n d p r e p a r a t i o nf o rs u b t m i tv a c c i n eo ft o x o p l a s m o s i s ，a n dS e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f a n t i g e n sa n dE
7、 x p l o r eo fP r o t e c t i v ei m m u n i t y T h et a c h y z o i t e so fT o x o p l a s m ag o n d i i R Hs t r a i nw e r ep u r i f i e db yd i s c o n t i n u o u sF l u i dl y m p h o c y t e sg r a d i e n t s ，t h e nw h i c h w a st r e a t e db yf i l t r a t i o na n dc e n t r i f u
8、 g a t i o n ，f r e e z e - t h a w e da n ds o n i c a t e d B a l b cm i c e w e r ei m m u n i z e df o rs i xt i m e sw i t hp u r i f i e dT a c h y z o i t e so fT o x o p l a s m ag o n d i ia n dt h e E L I S At i t e r sw e r ea l la b o v e1 ：6 4 0 0i nt h ee n d I n d i r e c tE n z y m e
9、 l i n k e dI m m u n o s o r b e n tA s s a y z ( E L I S A ) m e t h o dW a sd e v e l o p e d t od e t e c ta n t i b o d i e sa g a i n s tT o x o p l a s m ag o n d i i T h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ft h eE L I S A a r es e ta sf o l l o w s ：T o x o p l a s m ag o n d i ic r u d ea n
10、t i g e nd i l u t e db yc a r b o n a t eb u f f e r s o l u t i o n ( C B S ，p H9 6 ，0 0 5 m o l L ) i nl ：2 0a sac o a t e da n t i g e nd i s s o l v e d ，1 B S Aa sa b l o c k i n ga g e n tp o s t c o a t i n g ，h o r s e r a d i s hh e r o x i d a s e l a b e l e d s h e e pa n t i - m o u s
11、e I g G ( H R P - a n t iI g G ) d i l u t e db y P B S Ti n1 ：5 0 0 0a sas e c o n d a r ya n t i b o d y , a n d T M B ( 3 ，3 5 ，5 - t e t r a m e t h y lb e n z i d i n ed i h y d r o c h l o r i d e ) a s as h u s t r a t e T h es p e c i f i c i t y a n dr e p e t i t i v e n e s so ft h eE L I
12、 S Aw e r ep r i m e l yp r o v e db yt h eb l o c k i n gt e s t T h eE L I S A w a sc o n d u c t e dt od e t e c tt h ea n t i s e r ao fm o u s ea n dp r e s e n t e dg o o dr e s u l t s S p l e e nc e l l so f t h em i c ew e r es e l e c t e dt of u s ew i t hN S Oc e l l s T h ep o s i t i v
13、 ew e l l s w e r es e l e c t e db yi n d i r e c tE L I S A ，a n da f t e r3t o4g e n e r a t i o n so fc l o n eb yl i m i t e d d i l u t i o n ，4h y b r i d i z e dc e l lc l o n e s ( 3 A 3 ，3 G 3 ，4 F 4 ，4 G 3 ) a g a i n s tT o x o p l a s m ag o n d i i w e r eo b t a i n e dt h a tt h es o
14、 l u t i o nt i t e r sr a n g e df r o m1 ：8 0 0t ol ：12 ，8 0 0 ，a n da s c i t e st i t e r s w e r e1 ：512 0 0s h o w i n gg o o ds t a b i l i t y I d e n t i f i c a t i o nr e s u l t so fm o n o c l o n a la n t i b o d y s u b c l a s sW a s I g G 1 T h em o n o c l o n a la s c i t e sw e r
15、 ee x a m i n e dw i t hi n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y , w a sa g a i n s tT a c h y z o i t e s T h r e ea s c i t ec l o n e sw e r ep u r i f i e d a n dp a s s e dt h r o u g hS D S P A G Ee l e c t r o p h o r e s i s ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec h a i
16、 n i d e n t i f i e db yT g o n d i iA gs t r a i n sW a sa p p r o x i m a t e l y4 5k D a M o l e c u l a rw e i g h t so f b a n d si d e n t i f i e db yv a r i o u sM c A bs t r a i n sw e r ea l lo v e r5 5 k D a I m m u n o g e nw a sp r e p a r e du s i n gp u r i f i e dT o x o p l a s m ag o n d i iw i t h t h es a m e m e t h o d sa sa b o v e p i gh a db e e ni n j e c t e ds i xt i m e sw i t ho i l a d j u v a n t - v a c c i n e sa n d l
