开口箭多糖免疫调节作用的实验研究

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1、答辩委员会成员栗原博教授 李悦山教授 吕俊华教授 杨迎暴教授 论文评阅人谭焕然教授 史红研究员 陈娜娜副教授 2 0 1 0 年4 月1 5 日 硕士学位论文 开口箭多糖免疫调节作用的实验研究 硕士研究生：解燕 指导教师：雷林生教授 摘要 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 是生物体内普遍存在的一类高分子化合物，具有许 多重要的生理功能。多糖的药用研究始于1 9 4 3 年，6 0 多年来，人们从动物、 植物、微生物中提取分离了大量活性多糖，发现多糖具有促进机体免疫功能、 抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老、抗骨髓抑制和抗辐射等一系列作用，在临床 上已用于治疗肝炎、艾

2、滋病、癌症和许多其它疾病。免疫活性多糖因其来源广 泛、效果确切、毒副作用小等受到了普遍重视。 开I Z l 箭( T u p i s t r ac h i n e n s i sB a k e r ) 又名牛尾七、竹根七等，主要分布于我 国西南地区，民间主要用于治疗咽喉肿痛、风湿痹痛、跌打损伤、胃痛、毒蛇 狂犬咬伤、蚊虫叮咬等。开口箭属植物主要活性成分为皂苷，从该属植物根茎 中己分离提纯出多种皂苷成份。研究发现，开口箭具有良好的抗炎作用，有良 好的开发利用价值。皂苷是其抗炎的重要物质基础之一，抑制炎症介质P G E 2 、 N O 的产生是其作用机理；开口箭皂苷体外对H L - 6 0 、C

3、a s k i 、U 2 5 1 肿瘤细胞具 有明显的抑制作用，体内外对S i s o 肉瘤细胞也有很强的抑制作用；同时开口箭 皂苷还能够抑制血小板的聚集与活化。也有研究报道，开口箭水提物能明显抑 制炎症早期的水肿和渗出，具有抗炎镇痛的功效。我们在活性筛选时发现，开 口箭水提物具有一定的免疫活性，从而引起了我们的研究兴趣。本文对分离得 到的开口箭多糖组分T C B PI I ( T u p i s t r ac h i n e n s i sB a k e rp o l y s a c c h a r i d e sI I ， T C B PI I ) 的免疫调节作用及其机制进行了初步研究。

4、目的： 1 提取分离开口箭粗多糖并筛选出活性成分。 摘要 2 研究开口箭多糖( T C B P I I ) 体外对正常小鼠脾细胞代谢M T T 活力及产 生肿瘤坏死因子仅( T N F 仅) 、干扰素吖( I F N 吖) 、白细胞介素2 ( I L 2 ) 的影响； 体外对正常小鼠腹腔渗出细胞代谢M T T 活力及产生T N F a 的影响；体内对正 常小鼠迟发型超敏反应( D T H ) 、血清溶血素水平的影响。 3 研究开1 2 箭多糖( T C B PI I ) 体内对环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的D T H 、 单核巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素水平的影响。 4 研究开口箭多糖( T C

5、B P I I ) 对荷S 1 8 0 实体瘤小鼠抑瘤作用、血清T N F 仪、 I F N - r 含量及腹腔单核巨噬细胞吞噬功能的影响。 方法： 1 采用热水提取、乙醇沉淀法从开口箭植物的根茎中提取粗制多糖，再用 S e v a g e 法去蛋白。经D E A E S e p h a r o s ef a s tf l o w 阴离子交换柱对粗制多糖进行分 离纯化，得到不同组分开口箭多糖。通过测定不同组分多糖对正常小鼠脾脏淋 巴细胞增殖作用筛选出活性成分，命名T C B PI I 。 2 取正常小鼠脾细胞，加入开口箭多糖( T C B P I I ) ，在3 7 * ( 2 下培养4 8

6、h ， 收集培养上清，用E L I S A 方法检测其中T N F c L 、I F N - t 、I L 2 的含量，或者用 M T T 比色法检测细胞代谢M T T 活力。 3 取正常小鼠腹腔渗出细胞，加入开口箭多糖( T C B P I I ) ，在3 7 下培养 l O h ，收集培养上清，用E L I S A 方法检测其中T N F a 的含量，或者用M T T 比 色法检测细胞代谢M T T 活力。 4 正常小鼠5 0 只，随机分为5 组，生理盐水对照组、阳性药物( 灵芝多 糖1 0 0 m g k g ) 组、T C B P I I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0 0 ，2

7、0 0 m g k g ) 组，给药组 小鼠分别连续腹腔注射( i p ) 干预药物7 d 。于给药后第1 日用1 - - 硝基氟苯 ( d i n i t r o f l u o r o b e n z e n e ，D N F B ) 腹部致敏，末次给药后将1 D N F B 涂抹于5 组实验小鼠右侧耳廓，2 4 h 后处死动物，用打孔器取相同面积两侧耳片称重， 比较给药组与对照组耳廓肿胀程度。 5 正常小鼠5 0 只，随机分为5 组，生理盐水对照组、阳性药物( 灵芝多糖 I l 硕士学位论文 1 0 0 m g k g ) 组、T C B P I I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0

8、0 ，2 0 0 m g k g ) 组，给药组小 鼠分别连续i p 干预药物7 d 。给药后第2 天上午，各鼠腹腔注射2 0 ( V V ) 的 生理盐水兔红细胞0 2m l 进行免疫，同日下午继续给药，免疫后d 6 ( 免疫当 天为d O ) ，动物摘眼球取血，分离和收集血清用于血清溶血素水平测定。 6 皮下注射环磷酰胺( C T X ) 复制免疫功能低下的动物模型。小鼠5 0 只， 随机分为5 组，正常对照组、C T X 模型组、T C B PI I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0 0 ， 2 0 0 m g k g ) + C T X 组，采用D N F B 诱导迟发型变态反应(

9、d e l a y e d t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y ，D T H ) 模型，观察小鼠细胞免疫功能；碳廓清法检测单核巨噬 细胞的吞噬功能；兔红细胞免疫法检测体液免疫功能。 7 建立荷S 1 8 0 实体瘤小鼠动物模型，生理盐水对照组：每天腹腔注射( i p ) 无菌生理盐水0 1 m l 1 0 9 体重，其他组给药体积与此相同；阳性对照组：每天i p 灵芝多糖1 0 0m g k g ；T C B PI I 低、中、高剂量组：每天分别i pT C B PI I5 0 、1 0 0 、 2 0 0 m g k g ；连续给药7 d 后次日上

10、午，分离血清用于T N F - 仅和I F N 丫的含量测 定。取血后，分离瘤体，称重，并计算抑瘤率。 8 取荷S 1 8 0 实体瘤小鼠5 0 只，随机分为生理盐水对照组、阳性药物( 灵 芝多糖1 0 0m g k g ) 组、T C B PI I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 m g k g ) 组，每 组1 0 只，腹腔注射给药，每天1 次，连续7 天。停药2 4 h 后，每只小鼠腹腔注 射1 0 鸡红细胞悬液l m l ，3 0 m i n 后，脱颈椎处死动物，检测腹腔巨噬细胞的 吞噬活力。 9 统计分析采用S P S S1 3 0 统计软件，两样本均数比较，用

11、独立样本t 检 验( I n d e p e n d e n t S a m p l eTT e s t ) 。多个样本均数比较，经方差齐性检验后进行单 因素方差分析( O n e W a y A N O V A ) ，方差齐时，采用L S D 方法进行组间两两比 较；方差不齐时，作W e l c h 检验，再用D u n n e t t T 3 方法进行组间两两比较， 显 著性水准取5 = 0 0 5 ，以P 0 0 5 时，组间差异判断为具有统计学意义。 结果： 1 洗脱得三个多糖组分，分别命名为T C B PI 、T C B PI I 、T C B P I I I ：T C B PI l

12、 摘要 含量最多，T C B P l l 次之，T C B P I I I 最少。T C B PI 低、中、高浓度( 5 0 、1 0 0 、 2 0 0 p g m 1 ) 均无促进脾细胞代谢M T T 活力作用( P = - 0 5 9 7 ，P = - 0 3 9 8 ，P = 0 0 7 3 ) ， T C B P I I I 低、中浓度( 5 0 、1 0 0 9 9 m 1 ) 无促进脾细胞代谢M T T 活力( P = - 0 4 9 7 ， P = 0 3 9 8 ) ，高浓度( 2 0 0 I t g m 1 ) 可显著促进脾细胞代谢M T T 活力( P = 0 0 3 4

13、 ) 。 因此，T C B PI I 活性最高，用于后续研究。 2 T C B P I I 低、中、高浓度( 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 1 a g m 1 ) 均显著促进正常小鼠脾 细胞代谢M T T 活力( 尸= 0 0 4 8 ，P = 0 0 0 1 ，P = 0 0 0 0 ) ，促进正常小鼠脾细胞分 泌细胞因子T N F a ( P = - 0 0 1 6 ，P = - 0 0 0 0 ，P = - 0 0 0 0 ) ，且在一定的浓度范围内具 有剂量依赖趋势，但对I F N 吖、I L 2 的分泌无促进作用：T C B PI I 低、中、高浓 度( 5 0 ，1 0 0

14、，2 0 0 9 9 m 1 ) 显著增强正常小鼠腹腔渗出细胞代谢M T T 活力 ( 仁0 0 0 4 ，P = 0 0 0 0 ，P = - 0 0 0 0 ) ，促进腹腔渗出细胞分泌T N F a ( 尸= 0 0 4 4 ， P = - 0 0 0 1 ，P - - 0 0 0 0 ) ；T C B P I I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 r a g & g ) 对正常 小鼠D T H 反应耳廓肿胀度和兔红细胞免疫所致血清溶血素水平均无影响。 3 T C B PI I 中、高剂量( 1 0 0 ，2 0 0 r a g & g ) 可显著提高环磷酰胺诱导免疫抑

15、 制小鼠D T H 反应耳廓肿胀度( P - = 0 0 1 4 ，P = 0 0 0 6 ) ，提高免疫抑制小鼠细胞免 疫功能；T C B PI I 中、高剂量( 1 0 0 ，2 0 0 m g k g ) 可显著提高环磷酰胺诱导免疫 抑制小鼠体内碳粒廓清能力( P = - 0 0 1 7 ，P = - 0 0 1 2 ) ，提高免疫抑制小鼠腹腔巨 噬细胞吞噬功能；T C B PI I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 m g k g ) 均可显著提 高兔红细胞所致环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠血清溶血素水平( P = 0 0 1 l ， P = 0 0 0 1 ，P = 0

16、 0 0 0 ) ，提高免疫抑制小鼠体液免疫功能。 4 T C B P I I 低、中、高剂量( 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 m g k g ) 对小鼠S i s o 实体瘤生长 均有显著的抑制作用( P = O 0 0 0 ，P = 0 0 0 0 ，P = 0 0 0 0 ) ，抑瘤率分别为2 6 7 ， 3 2 5 ，4 0 7 ；同时，T C B PI I 中、高剂量( 1 0 0 ，2 0 0 m g k g ) 可显著提高荷S l s o 实体瘤小鼠血清中T N F O r , 的水平( P - - 0 0 3 9 ，P = 0 0 0 1 ) ，但对I F N - 7 的水平无 影响。T C B P I I 中、高剂量( 1 0 0 ，2 0 0 r a g & g ) 可显著促进荷S 1 8 0 实体瘤小鼠腹 腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞( C I m C