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1、A n t i f u n g a lM e c h a n i s mo fP l a g i o c h i nE ，a nA n t i f u n g a l A c t i v eB i s ( b i b e n z y l s ) ，a g a i n s tC a n d i d aa l b i c a n s 作 专 导 合作导师 2 0 1 0 年5 月2 8 日 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的
2、个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：黑盔题 日 期：墨塑墨：垄! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：羔查塑导师签 山东大学博士学位论文 目录 中文摘要l 英文摘要4 符号说明8 第l 章前言9 1 1 临床真菌感染流行病学9 1 2 真
3、菌耐药10 1 3 克服真菌耐药性的策略1 6 1 4 抗真菌剂及其作用机制18 1 5 真菌凋亡途径2 4 1 6 苔藓植物中的生物活性成分3 1 1 7 本课题研究内容及意义3 3 参考文献3 4 第2 章基因芯片技术分析羽苔素E 作用后白色念珠菌的差异基因表达谱4 1 2 1 实验材料4 l 2 2 实验方法4 3 2 3 实验结果4 6 2 4 讨论6 0 参考文献6 1 第3 章羽苔素E 通过诱导真菌细胞内活性氧累积导致细胞死亡6 4 3 1 实验材料6 4 3 2 实验方法6 6 3 3 实验结果7 0 3 4 讨论8 0 参考文献8 2 第4 章羽苔素E 通过激活m e t a
4、c a s p a s e 诱导真菌凋亡8 6 4 1 实验材料8 7 4 2 实验方法9 0 4 3 实验结果9 5 山东大学博士学位论文 4 4 讨论1 0 4 参考文献。10 7 第5 章羽苔素E 抑制白色念珠菌细胞壁中几丁质的合成1 1 2 5 1 实验材料。113 5 2 实验方法。11 6 5 3 实验结果。11 9 5 4 讨论12 4 参考文献12 6 第6 章苔藓植物中羽苔素E 的化学生态学意义研究1 2 9 6 1 实验材料12 9 6 2 实验方法131 6 3 实验结果1 3 4 6 4 讨论1 4 1 参考文献1 4 2 1 改谢1 4 5 攻读学位期间发表的学术论文
5、目录1 4 6 山东大学博士学位论文 双联苄类化合物羽苔素E 的抗真菌机制 专业：药物化学 研究生：吴秀祯 导师：娄红祥教授 中文摘要 近年来，随着广谱抗生素的大量应用、艾滋的蔓延、癌症化疗和器官移植所 引起的免疫抑制的增加、以及器官插管术的广泛开展，临床真菌感染的发病率和 死亡率呈逐年上升趋势。特别是持续性免疫缺陷患者，其真菌感染率更高。真菌 感染，特别是深部真菌感染难以治疗。临床常用抗真菌药物主要是唑类药物和两 性霉素B ，这些抗真菌药物均对人体有不同程度的毒副作用；且随着抗真菌药物 的广泛应用，临床上出现越来越严重的真菌耐药现象。因此，临床上迫切需要寻 找新的抗真菌药物来治疗真菌感染。
6、苔藓植物是植物界中仅次于被子植物的高等植物，全世界约有2 3 0 0 0 种。其 中藓( m o s s e s ) 1 4 0 0 0 余种，苔( 1 i v e r w o r t s ) 6 0 0 0 余种，角苔( h o m w o r t s ) 3 0 0 余种。 其在系统发育学上位于藻类和蕨类植物之间。在中国和印度，苔藓植物作为一种 传统药物，被用来治疗心血管疾病、扁桃体炎、支气管炎、中耳炎、膀胱炎、皮 肤病以及烧伤等。近年来植物学家从苔藓植物中分离获得了大量结构新颖且活性 显著的萜类化合物和芳香族化合物，其中许多可作为新药研究的优良先导化合 物。对苔类植物活性成分的研究表明苔
7、类植物是生物活性天然产物的重要来源。 地钱属植物为叶状体苔类。从地钱中分离得到的大环双联苄具有广泛的生物 学活性，如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗细菌和细胞毒活性等，因此它们受到越 来越多的关注。羽苔素E 是从地钱( M a r c h a n t i a p o l y m o r p h aL ( M a r c h a n t i a c e a e ) ) 中分离得到的一种双联苄类化合物。药理学活性实验表明2 1 2I _ t g r n l 羽苔素E 可以逆转阿霉素诱导的K 5 6 2 A 0 2 细胞的多药耐药性，而对正常细胞仅表现微弱 毒性。进一步研究发现，羽苔素E 有抗白色念珠菌的
8、作用，并通过提高耐药真菌 细胞内氟康唑药物浓度而逆转真菌耐药。提示羽苔素E 具有非常好的药物开发价 值。但是羽苔素E 的抗真菌作用机制尚未阐明。因此，本课题的目的就是通过一 系列实验阐明羽苔素E 的抗真菌机制。 山东大学博士学位论文 基因表达谱分析技术为羽苔素E 的抗真菌机制研究提供了全新和有效的研究 手段。利用白色念珠菌基因组芯片绘制了羽苔素E 作用后白色念珠菌的基因表达 谱，分析比较相互问的不同，在全基因范围内寻找受羽苔素E 影响的相关基因。 基因芯片结果显示多个被羽苔素E 上调或下调的基因与线粒体功能有关。而线粒 体是细胞内的重要细胞器，在氧代谢、A T P 产生和钙平衡中发挥重要作用。
9、提示 线粒体是羽苔素E 的潜在抗真菌靶点。因此，实验进一步测定了羽苔素E 对白色 念珠菌线粒体功能的影响。在实验中，采用罗丹明染色法测定羽苔素E 作用后白 色念珠菌的线粒体膜电势，高效液相色谱法测定白色念珠菌线粒体内A T P 含量， 分光光度法测定线粒体F o F l - A T P a s e 和脱氢酶活性，荧光法测定线粒体内活性氧 含量。实验结果显示羽苔素E 导致白色念珠菌线粒体膜电势超极化和线粒体内 A T P 耗竭。线粒体F o F l - A T P a s e 水解A T P 的活性被显著提高，使得线粒体内A T P 被过度水解，导致线粒体内A T P 耗竭。在水解A T P 的
10、同时，F o F l - A T P a s e 将质子由 线粒体胞浆泵入线粒体膜间隙，进而导致线粒体膜电势超极化。线粒体脱氢酶的 活性被显著抑制，引起真菌细胞内能量代谢异常，导豸t A T P 合成减少。羽苔素E 所致线粒体功能的异常导致线粒体内活性氧累积。抗氧化剂半胱氨酸不但可以抑 制羽苔素E 诱导的线粒体内活性氧累积，而且可以抑制羽苔素E 的抗真菌活性。 提示活性氧是羽苔素E 发挥抗真菌作用的关键介质。 活性氧是真菌凋亡的关键调节因子。因此，实验进一步研究羽苔素E 诱导的 白色念珠菌线粒体活性氧累积是否导致真菌凋亡。实验采用流式细胞术检测羽苔 素E 作用后细胞周期的变化，超薄透射电镜观察
11、真菌超微结构的改变，D A P I 染色 法观察细胞核形态变化，F I T C a n n e x i nV 染色法观察白色念珠菌磷脂酰丝氨酸的 外翻，R T P C R 法测定羽苔素E 对白色念珠菌C D C 2 8 、C L B 2 和C L B 4 表达水平的影 响，F I T C V A D F M K 荧光染色法测定羽苔素E 作用后白色念珠菌m e t a c a s p a s e 活 性，分光光度法测定线粒体内细胞色素C 含量。实验结果显示羽苔素E 导致白色 念珠菌出现典型的凋亡特征，包括细胞周期阻滞在G 2 M 期、染色体凝集、细胞 核裂解和磷脂酰丝氨酸的外翻。提示羽苔素E 导
12、致了白色念珠菌细胞凋亡。 C D C 2 8 、C L B 2 和C L B 4 的表达被羽苔素E 下调，导致白色念珠菌细胞周期阻滞。 羽苔素E 促进白色念珠菌线粒体内细胞色素C 释放，并激活 “ m e t a c a s p a s e 。抗氧 化剂半胱氨酸抑制羽苔素E 导致的细胞核裂解、磷脂酰丝氨酸的外翻以及 2 山东大学博士学位论文 m e t a c a S p 嬲e 的活化，提示活性氧是羽苔素E 所致细胞凋亡的重要介质。实验结果 表明羽苔素E 通过引起白色念珠菌线粒体活性氧累积，进而激活m e t a c a s p 嬲e 诱导 真菌凋亡，从而发挥其抗真菌作用。 细胞壁是真菌细胞的重要结构，完整的细胞壁为刚性结构，作为物理化学屏 障保护细胞及其内的酶类，并控制细胞内膨胀压力以维持菌体的完整性。细胞壁 还参与调节营养物质的吸收和代谢产物的分泌，在维持真菌的生长和正常的生理 功能中起到重要作用。几丁质是真菌细胞壁的主要成分之一。几丁质合成酶催化 N 乙酰氨基葡萄糖在细胞膜上聚合成几丁质，在真菌细胞的分裂和成熟中发挥重 要作用。在前期实验中，透射电镜结果显示羽苔素E 处理后的白色念珠菌细胞壁 出现明显损伤，并且细胞分裂受阻
