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1、浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - I - 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系 的建立及其应用 论文作者签名论文作者签名: 黄 昌 军 指导教师签名指导教师签名: 周 雪 平 论文评阅人： 双向隐名评审 答辩委员会主席： 陈剑平 研究员 浙江省农业科学院 委员 1： 张鹏 研究员 上海植物生理研究所 委员 2： 陈集双 教授 浙江理工大学 委员 3： 华跃进 教授 浙江大学 委员 4： 宋凤鸣 教授 浙江大学 委员 5： 洪 健 研究员 浙江大学 委员 6： 周雪平 教授 浙江大学 答辩日期： 2009 年 6 月 10 日 浙江大学博士
2、学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - II - Establishment of virus induced gene silencing using geminivirus DNA1 molecule and its application Authors signature: Changjun Huang Supervisors signature: Xueping Zhou Thesis reviewer： Anonymously Chair： Jianping Chen, Investigator Committeeman1： Peng Zhang,
3、Investigator Committeeman2： Jishuang Chen, Professor Committeeman3： Yuejin Hua, Professor Committeeman4： Fengming Song, Professor Committeeman5： Jian Hong, Investigator Committeeman6： Xueping Zhou, Professor Date of oral defence： June 10th, 2009 浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - III - 浙江大学研究
4、生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：2009 年 6 月 2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 浙江大学浙江大学 可以将学位论文的全部
5、或部分内容编入有关数据库进行检索和传播， 可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：2009 年 6 月 2 日 签字日期： 2009 年 6 月 2 日 浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - IV - 致致 谢谢 时光荏苒，五年的博士生活转眼而过，心中感慨万千。从刚进实验室的科 研菜鸟，到能够独立的进行实验操作，完成博士论文，一路走来有太多的人需要 感谢。正是大家各方面的帮助和指导才能让我一直坚定地走下去。 首先我要感谢导师周雪平教授我在学业上的悉心
6、教导和生活上无微不至的 关怀。本论文在论文选题、实验设计、结果分析和论文撰写的各个方面，导师倾 注了许多的心血。五年来的成长得益于导师的言传身教和悉心培养，因为本人的 基础薄弱，花费了导师大量的精力来培养学生成才。每当夜半时分走过导师门前 看到他依然伏案操劳时，每当遇见科研瓶颈经导师指点茅塞顿开时，每当看见导 师工作繁重却依然热切的关心学生生活和科研时， 我都被导师兢兢业业的治学态 度、敏锐创新的科学思维和平易近人的大家风范深深感动。值此论文交付之际， 谨向导师的教诲和关怀表示最诚挚的感谢和由衷的敬意。 衷心感谢李桂新老师、钱亚娟老师、谢艳老师、吴建祥老师和谢好老师在 实验室管理方面做出的贡献
7、，以及在生活上给予的诸多帮助和建议。感谢马忠华 老师、安千里老师、孟春梅老师以及徐幼平老师在实验中给予的帮助和指导。 五年的博士生涯，实验室所有兄弟姐妹们在工作、学习和生活中给予了无 限的支持和帮助，在此谨表示深深的谢意。非常荣幸能是这样一个优秀团队中的 一份子，像一个温馨的大家庭，大家互相学习，互相帮助。特别感谢胡高洁、张 彤、刘培、张馨月、黄凌哲和巩焕然等师弟师妹在实验中提供的诸多帮助，还有 陶小荣、李正和、吴佩君、吴楚钊、吴剑丙等师兄师姐等对我科研思路的启迪和 帮助，留恋和张辉、丁陈君博士以及陈冰硕士一起奋斗的日子；另外，也感谢杨 秀玲、刘舟等在实验室管理上作出的贡献。 我也感谢张小波、
8、严蕾艳、蒋金花、徐秋芳、刘成科、张慧娟、刘剑、栾 军波和王继业同学的大力帮助， 正是你们的帮助让我有机会学习病毒学专业以外 的许多知识。同时感谢Ulrich Melcher教授（Oklahoma State University）对论文提 出的宝贵意见，以及Andrew Jackson教授和丁守伟教授在科研思路上的启发和开 导，让我受益匪浅。 我要感谢我的父母和姐姐，为了支持我的学业默默的付出了许多。虽然他 们并不知道我在研究什么，但依然无私的给我鼓励和支持。在此，还要特别感谢 浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - V - 我的女朋友葛林梅，虽然她
9、发的文章比我好，拿的工资比我高，却依然无怨无悔 地支持和理解我的科研和学业。似海亲恩，何以为报！ 偶尔我也感激自己，感谢自己的坚持和执着让我从看到实验仪器不知所措 成长到相信自己也能在科研上取得小小成绩。我将带着这种自信上路，继续我的 人生故事。 黄 昌 军 2009年5月于华家池 浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - VI - 摘摘 要要 病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing, VIGS）是指携带一段植 物功能基因 cDNA 的病毒载体侵染植物后诱导植物功能基因发生沉默，通过产 生的表型或生理指标变化来反映
10、该基因功能的一种方法。 本文利用烟草曲茎病毒 （TbCSV）DNA1 卫星构建了一种新型的基因沉默载体 2mDNA1。该载体能与 同源辅助病毒一起侵染烟草植物，可以抑制转基因 GFP 和内源基因 Su 的表达， 产生明显的表型突变。利用 2mDNA1 还可以与异源双生病毒中国番茄黄化曲叶 病毒（TYLCCNV）在植物上建立有效的基因沉默体系。该体系不仅可以抑制转 基因 GFP 的表达， 也可以抑制内源基因 Su 的表达， 并且不产生任何的病毒症状。 它可以诱导分生组织特异性表达和胚胎致死的 PCNA 基因发生沉默； 可以在矮牵 牛花上沉默 CHS 基因；并且该体系也可以同时抑制两个基因的表达；
11、在该载体 上插入 170 bp-1155 bp 的片段都可以诱导有效的基因沉默；此外，它在所有已测 定的 6 种寄主植物都能诱导高效的基因沉默。因为 DNA1 能够与不同的辅助病 毒相伴随，扩大了 DNA1 的寄主范围，使得 DNA1 能够在更多的寄主上进行功 能基因的研究。 利用2mDNA1和TbCSV对其在普通烟中的沉默体系进行了优化， 优化后的沉默体系不仅能够高效沉默转基因普通烟， 也能在多个普通烟品种中高 效沉默植物内源基因 Su，并且沉默效果持久，沉默可以在 18-32温度下诱导。 利用 DNA1 沉默载体，开展了基因功能的研究。从本氏烟扩增到 TOM 类 寄主因子 NbTOM1 和
12、 NbTOM3 的基因片段，通过沉默研究证明 NbTOM1 和 NbTOM3 的沉默能够降低 TMV 的复制， 但是只有同时沉默 NbTOM1 和 NbTOM3 两个基因才能够完全抑制 TMV 的复制， 表明 NbTOM1 和 NbTOM3 是 TMV 复制 所需的寄主因子。 利用 TbCSV 和 2mDNA1 研究了普通烟 NtEDS1 基因在 N 基因 介导的抗 TMV 中的作用。当 NtEDS1 被沉默后，TMV 在含 N 基因普通烟中不 再产生过敏性反应(HR)，而表现出 TMV 系统侵染的病毒症状。证明了 NtEDS1 在 TMV 诱导的 HR 反应中有着重要作用，这是利用 VIGS
13、 在普通烟中研究抗病 相关基因的首次报道。利用 2mDNA1 和 TYLCCNV 的沉默体系初步研究了本氏 烟中叶片发育相关基因 NbPHAN 的功能。当 NbPHAN 被沉默后叶片发育产生明 显的改变。叶片背腹极性改变，叶片皱缩、下卷并在叶片上表面产生耳突。全基 因比对发现 NbPHAN 是典型的 AS1/PHAN 类的基因，包含保守的 MYB 核酸结 浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - VII - 合域以及 C 端的 CTD 结构域。 酵母双杂交试验发现 NbPAHN 和 AtAS1 一样， 能 够和拟南芥中的 AtAS2 互作，决定这种互作
14、的氨基酸位于 NbPHAN 的中间区域； NbPHAN 也能够自我互作并且保守的 C 端 CTD 域决定了这种互作。NbPHAN 定 位在核仁内，并且基因 MYB 结构域决定了该基因的亚细胞定位。下一步将继续 研究 NbPHAN 基因在致病性中的作用。 关键词：病毒诱导的基因沉默；双生病毒；DNA1 分子；基因功能。 浙江大学博士学位论文 双生病毒 DNA1 分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用 - VIII - Abstract Virus induced gene silencing (VIGS) is currently recognized as a powerful reverse
15、genetics tool for application in functional genomics. VIGS is induced by infecting a plant with a plant virus that has had its genome modified to include a sequence identical to that in RNA transcribed from the host gene to be silenced. DNA1, a single-stranded DNA molecule associated with begomoviru
16、ses (Family Geminiviridae), was shown to replicate autonomously but required the helper virus for its dissemination. In this paper, we developed a VIGS vector based on the DNA1 component of Tobacco curly shoot virus (TbCSV), a monopartite begomovirus, by inserting a multiple cloning site (MCS) between t
