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1、1,细胞自噬机制 主讲人：晏剑虹,克里斯汀德迪夫（Christian deDuve）,比利时科学家Christian de Duve在上世纪50年代通过电镜观察到自噬体（autophagosome）结构，并且在 1963 年溶酶体国际会议（CIBA Foundation Symposium on Lysosomes）上首先提出了“自噬”这种说法。因此Christian de Duve被公认为自噬研究的鼻祖。Christian de Duve 也因发现溶酶体，于1974年获得诺贝尔奖,大隅良典,2016年，因“在细胞自噬机制方面的发现”而获得诺贝尔生理学或医学奖。大隅教授的贡献在于，他找到了酵母
2、这种简单又与人体细胞相似的实验模型，将复杂的问题化难为易了。,大隅良典,宫崎骏,在酵母菌体内(左侧)存在一个巨大的细胞器，名为液泡，其功能与人以及其他哺乳动物体内细胞内的溶酶体相类似。于是他培养了经过改造，缺乏液泡膜降解酶的酵母菌并通过饥饿的方法激活细胞的自噬机制。此时，当这些酵母菌遭受饥饿时，吞噬小体开始在液泡内部大量聚集(右图)。大隅良典的实验证明酵母菌内部存在自噬现象。此后，大隅良典教授对数以千计的酵母菌变异样本进行了核对(右侧)，并从中找到了据信与自噬作用密切相关的15组基因。,凋亡与自噬,表中可以看出，在过去的十年之中，几乎每个生命科学家都知道“凋亡”这个概念并且有意无意将自己的研究
3、工作与之挂钩。自噬（autophagy）是继凋亡（apoptosis）后，当前生命科学最热的研究领域，Pubmed记录的文献数量在最近4年呈爆炸式增长，其中2006年以前相关文献大约1500条。2007年是自噬研究有历史意义的一年，召开了第一次自噬国际会议，与会人员构成自噬学术圈的奠基者，并且在各自领域宣传和研究一些基本概念。2007年到2010年9月短短三年文献发表量达到大约4400条。我们坚信在未来十年“自噬”也将会成为另一个“万金油”和生命科学的“闪亮新星”。,在大隅良典发现细胞自噬的关键机制之后，研究局面豁然开朗，相关论文发表量骤然上升。,细胞自噬的定义,细胞自噬(autophagy)
4、是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。,细胞自噬基本过程,自噬基本过程： 1.自噬前体的形成 2.自噬体的形成 3.自噬溶酶体的融合 4.自噬体的溶解,内涵体,自噬内涵体,溶酶体,自噬溶酶体,自噬前体,自噬体,细胞自噬分类（根据进入溶酶体途径不同）,巨自噬 微自噬 分子伴侣介导的自噬,巨自噬,内外刺激诱导下，细胞通过自噬基因调控组装自噬前体。自噬体包裹细胞质,细胞器或细菌等形成自噬体，在微管作用下，自噬体与溶酶体靠近，自噬体外层膜与溶酶体膜融合，包有内层膜
5、的自噬体进入溶酶体，形成自噬溶酶体。继而，自噬体内膜被溶酶体酶降解，继而内容物被降解，营养成分被细胞重新利用。,微自噬,主要集中于酵母。当受到饥饿等刺激时，溶酶体膜局部凹陷，吞噬细胞质或微体，形成自噬体。自噬体脱离溶酶体膜，进入溶酶体腔，由溶酶体酶降解，降解物质被细胞再利用。,分子伴侣介导的自噬（CMA）,分子伴侣介导的自噬（CMA）：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。 分子伴侣：一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装
6、完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能的组份,自噬的特性,1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解
7、消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别 5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。 6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。,微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3）,12135-1-AP,微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3），简称LC3，参与了自噬的形成
8、，并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一。Western blot可能会检测到LC3的两种形式，这是由于自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），这两种形式在正常细胞中都是存在的，而发生自噬的细胞中LC3-II会有明显的增加。,自噬小体的增多有两种可能,一是形成增加即自噬被诱导； 另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。 自噬诱导剂 1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 2）Carbamazepine/ L
9、-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶） 3）Earles平衡盐溶液：制造饥饿 4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂 5）Rapamycin：mTOR抑制剂 6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂,自噬的抑制剂,根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下： （1）对自噬体形成的抑制：主要
10、是PI3K通路的抑制剂（如3-MA），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。 （2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。 （3）对溶酶体降解的抑制：蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等,自噬体的检测,（1）以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测。 （2）自噬体膜标志性蛋白质的检测。 （3）单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。 （4）检测长寿蛋白的批量降解 （5）CellTrackerTM Green染色,细胞自噬功能,（1）细胞自噬通过防御环境变化和应激代谢反应调控来维持细胞内部 的稳态。
11、（2）细胞自噬具有自我“清理”功能，可以处理细胞内的废物，降解 错误折叠的 蛋白质多聚体，减少DNA的损伤和染色体的不稳定性， 防止异常蛋白质累积，还能降解功能 失常的线粒体、高尔基体等 细胞器，对蛋白质和细胞器进行质量控制 ，并且通过降解底物来为细胞生存提供原材料或ATP （3）细胞自噬甚至可以清除细胞内的病原体，保护细胞免受损伤，对于对抗癌症、衰老、神经退行性病变、感染等都有着重要的意义。 （4）细胞自噬是程序性细胞死亡的一种，在某些情况下，若细胞无法 继续维持自身的生存，细胞自噬会诱导细胞主动性死亡。,细胞自噬与肿瘤的治疗,自噬与肿瘤的关系,与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬
12、是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强 ，表现为胞浆中迅速
13、涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。,自噬可为肿瘤细胞带来几大好处,1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。 2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。,25,谢谢！,
