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1、,第10章 生物传感器,10.1 生物传感器的原理与分类 10.2 酶传感器 10.3 免疫传感器 10.4 基因传感器 思考题与习题,10.1 生物传感器的原理与分类 10.1.1 生物传感器的原理 生物传感器由生物敏感膜与变换器构成，如图10.1所示。被测物质经扩散作用进入生物敏感膜层，经过分子识别发生生物学(物理、化学)反应，产生物理、化学现象或热、光、声等信号，然后由相应的变换器将其转换为易于检测、传输与处理的电信号。,图10.1 生物传感器构成,10.1.2 生物传感器的分类 生物传感器的分类方法有很多，常用的有两种分类方法，即按生物活性物质(分子识别元件)和变换器来分，如图10.2
2、所示。 按生物活性物质不同可分为五类：酶传感器、微生物传感器、细胞器传感器、组织传感器和免疫传感器，如图10.2(a)所示。 按变换器不同可分为六类：生物电极、热生物传感器、介体生物传感器、半导体生物传感器、压电晶体生物传感器和光生物传感器，如图10.2(b)所示。,图10.2 生物传感器分类,10.2 酶传感器 10.2.1 酶反应 1. 酶 酶是生物体内产生的具有催化活性的一类蛋白质，能催化许多生物化学反应。生物细胞的代谢就是由成千上万个不同的酶来控制的。按酶的催化反应类型可分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶(合成酶)等六类。酶具有以下特性： 1) 酶的高效催化性 酶作
3、为一种生物催化剂，参与所有新陈代谢过程中的生化反应，使得生命赖以生存的许多复杂化学反应能在常温下发生，并以极高的速度和明显的方向性维持生命的代谢活动。,2) 酶催化反应的高度选择性 酶不仅具有一般催化剂加快反应速度的作用，而且具有高度的选择性，如淀粉酶则只能催化淀粉水解。酶的这种选择性及其催化低浓度底物反应的能力在化学分析上非常有用。 酶的催化效率极高且具有高度选择性，只对特定的待测生物量(底物)进行选择性催化，并有化学放大作用。因此利用酶的特性可以制造灵敏度高、选择性好的传感器。,2. 酶反应 酶的催化反应可用下式表示 式中：S待测物质； E酶； T反应温度； Pi第i个产物。,(10.1)
4、,10.2.2 酶电极传感器 1. 电流型酶电极 酶催化反应产生的有关物质会在电极上发生氧化或还原反应，电流型酶电极是利用氧化或还原反应所得的电流来确定反应物的浓度，其基础电极可采用氧、过氧化氢等，或采用铂、钯和金等。 以研究最早、最成熟的葡萄糖氧化酶传感器为例，它是由葡萄糖氧化酶敏感膜和电化学电极组成。葡萄糖氧化酶敏感膜固定在聚乙烯酰胺凝胶上，电化学器件为Pt阳电极和Pb阴电极，中间溶液为强碱溶液，阳电极上覆盖一层透氧的聚四氟乙烯膜，形成封闭式阳电极，避免电极与被测溶液直接接触，防止电极被毒化。其结构如图10.3所示。,图10.3 葡萄糖氧化酶传感器,将葡萄糖氧化酶传感器插入到被测的葡萄糖溶
5、液中，葡萄糖(C6H12O6)受到葡萄糖氧化酶(GOD)的催化作用发生如下反应 葡萄糖在反应中消耗氧，生成葡萄糖酸(C6H12O7)及H2O2，H2O2通过选择性半透膜，在Pt电极上氧化并产生电流，其电流与进入氧化反应的葡萄糖量成正比关系。对浓度为1000 mg/mL 的葡萄糖溶液，反应时间约为20 s左右，测量精度可达1%。如果在Pt电极上加0.6 V的电压，则H2O2在Pt电极上产生氧化电流的过程可用下式表示,(10.2),(10.3),2. 电位型酶电极 电位型酶电极是将酶反应所引起的物质变化转换成电位信号输出，电位信号的大小与底物浓度的对数之间有线性关系。其基础电极有PH电极、气敏电极
6、等，它影响酶电极的响应时间、检测下限等性能。电位型酶电极的适用范围，不仅取决于底物的溶解度，更取决于基础电极的检测限。 例如，尿素(CO(NH2)2)电极是一种属于水解酶体系的酶电极。在医学临床上，用于分析患者的血清和体液中的尿素，对肾功能进行诊断。另外，对尿毒症患者进行人工透析时，确定透析次数和透析时间，必须依靠尿素的定量分析。尿素在脲酶作用下发生水解反应,被测底物与酶电极酶膜发生酶反应，生成的阳离子被离子选择性电极所识别，在电极上转换输出的电位与被测离子浓度的对数呈线性关系，即,(10.4),(10.5),电位型酶电极的线性范围为102104 mol/L。有些上限可延伸到101 mol/L
7、，有些下限可延伸到105 mol/L或更低。 电位型酶电极的变质可以通过三个响应特性来观测： (1) 随使用时间的增加，上限减小； (2) 电位对浓度的对数曲线斜率逐渐变小； (3) 电极响应时间开始一般为30秒到4分钟(与转换器的时间大致相同)，随着酶的老化变质，响应时间会变长。,10.2.3 场效应管酶传感器 场效应管酶传感器(ENFET)是由有机物敏感膜和ISFET (氢离子场效应管)构成。将FET栅极金属去掉，把酶固定在栅极氢离子敏感膜表面，样品溶液的待测底物扩散进入酶膜。 FET-脲酶传感器的结构如图10.4所示。,图10.4 FET-脲酶传感器的结构,10.2.4 光纤酶传感器 光
8、纤酶传感器主要由光纤和酶敏感膜组成，其工作原理如图10.5所示。,图10.5 光纤酶传感器的工作原理,例如，利用固定化酯酶或脂肪酶做成生物催化层进行分子识别，再通过所生成产物的光吸收对底物浓度进行生物传感。以测定对硝基苯磷酸酯含量为例，用固化的碱性磷酸酶进行分子识别，待测的对硝基苯磷酸酯在催化作用下生成对硝基苯酚和磷酸，并在光纤中传送404 nm波长的光到达传感端，得到稳定的光信号，通过测量在404 nm波长下光吸收的变化，可确定对硝基苯磷酸酯的含量，其线性范围为0400 mol/L，生物体内很多酯类和脂肪类物质都可用类似的传感器进行测定。,(10.6),目前应用最多的是检测烟酰胺6-氨基嘌呤
9、双核苷酸(NADH)的光纤酶传感器，这种传感器的探头用脱 氢酶进行分子识别。在含有乳酸(C3H6O3)的溶液中加入氧化型烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD+)，当pH为8.6时，在探头中固定化乳酸脱氢酶的催化作用下，发生如下反应，生成丙酮酸(C3H4O3)和NADH。,(10.7),目前，酶传感器已有数百种实现了商品化，常用酶传感器的特性见表10.1。,表10.1 常用酶传感器的特性,10.3 免 疫 传 感 器 10.3.1 免疫反应 免疫是生物体的免疫系统对侵入自身的微生物，如细菌、病毒等病原体或异物产生特异性抵抗力的现象，这种生物化学过程称为免疫反应。免疫传感器就是利用免疫反应来测定物质的。
10、在免疫反应中，引起生物体免疫反应的物质称为抗原。生物体内因抗原的侵入而产生的并与抗原产生特异性结合而发生免疫反应的物质称为抗体。利用抗原与抗体的反应，即免疫反应来进行分子识别的方法称为免疫识别。免疫识别是最为重要的生物化学分析方法之一，可用于测定各种抗体、抗原以及能进行免疫反应的多种生物活性物质。,利用抗体具有识别抗原并与抗原结合的双重功能，将抗体或抗原和换能器组合而成的装置称为免疫传感器。由于蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等，当固定化抗体(或抗原)与相应的抗原(或抗体)结合时，会产生电学、化学、光学等变化，通过适当的传感器可检测这些参数，从而构成不同的免疫传感器。 免疫传感
11、器具有三元复合物的结构，三元复合物即感受器、转换器和电子放大器。在感受器单元中，抗体与抗原选择性结合产生的信号敏感地传送给换能器，抗体与被分析物的亲和性结合具有高度的特异性。免疫传感器的优劣取决于抗体与待测物结合的选择性和亲和力。,10.3.2 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是由分子识别系统和电化学转换器组合而成，分子识别系统是指固定化的抗体或抗原。固定化的抗体或抗原在与相应的抗原或抗体结合时，自身发生变化，但变化比较小。为此利用酶的化学放大作用，使抗体与抗原结合时产生明显的化学量变化。 电化学免疫传感器所用的电极可以是电流型，也可以是电位型，取决于标记酶的底物或底物的反应产物的种类。,1
12、. 电位型免疫传感器 1975年Janata首次提出用电位测量来监测免疫化学反应，其原理是先用聚氯乙烯膜将抗体固定于金属电极上，然后用相应的抗原与抗体特异性结合，抗体膜中的离子迁移率随之变化，从而使电极上的膜电位也发生相应变化，膜电位的变化与待测物浓度之间有对数关系。但由于灵敏度较低，没能投入实际应用中。到了20世纪80年代，Rechnitz把离子选择性电极、pH电极等引入到电位型免疫传感器中，提高了传感器的灵敏度。如离子选择性电极，它是将抗原和离子载体共价结合，然后固定在电极表面膜上，当底物中的抗体与固定抗原选择性结合时，膜内离子载体性质发生改变，导致电极上电位变化，由此可测得抗体浓度。,2
13、. 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器的原理是利用抗原与抗体结合来催化氧化还原反应，反应产生电活性物质，引起电流值变化，从而确定样品中抗原的浓度。,10.3.3 光学免疫传感器 1. 标记型光学免疫传感器 酶可以作为标记物催化生成一些产物，这些产物能吸收光线，发出荧光或磷光。其中磷光的灵敏度很高，荧光团也可做标记物，它在被激发后可直接发出荧光。因此，这类光学免疫传感器无需光源，设计简单，但检测的光强度很低，需要复杂的检测仪器。为了减小传感器的体积，简化检测仪器，引入了光导纤维，从而构成了光纤免疫传感器。,2. 非标记型光学免疫传感器 非标记光学传感技术是利用光学技术，直接检测传感器表面的光线吸
14、收、荧光、光线散射或折射率的微小变化，在免疫传感器中很有发展前景。这类免疫传感器的原理是基于内反射光谱学，它由两种不同折射率的介质组成，高折射率的介质通常为玻璃棱镜，低折射率的介质表面固定抗原或抗体。,3. 电化学发光免疫传感器 电化学发光分析是利用电解技术在电极表面产生某些电活性物质，并通过氧化还原反应而导致化学发光。应用光学手段测量发光光谱和强度即能对物质进行痕量检测。与其他检测方法相比，它具有一些明显的优势。标记物比大多数化学发光标记物稳定，由于是电促发光，只有靠近电极表面并且带有标记物的部分才能被检测到。,10.3.4 压电晶体免疫传感器 压电晶体免疫传感器是一种质量测量式免疫传感器，
15、其原理是石英晶片在振荡电路中振荡时有一个基本频率，当被测物中的抗原或抗体与固定在晶片上的抗体或抗原结合时，由于被吸附物增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与被吸附物质量有关。该类传感器早期只限于气相测定，即晶片在样品缓冲液中与待测物反应，取出干燥后才能测定频率变化，这样晶片起振比较容易，能避免非特异性吸附对结果的影响，有较好的线性关系，但增加了操作时间，而且干燥过程对蛋白质的活性有损害，会缩短传感器的寿命。,最好的解决办法就是在液相中直接检测晶体表面质量的变化，然而由于液相中阻尼较大，晶体不易产生压电谐振，为此利用ST切割(对Y轴旋转42.75切割石英晶体的方法)压电器件在液相中进行质量免
16、疫检测，避免了干燥过程带来的不利影响。,压电晶体免疫传感器主要应用于以下几个方面： (1) 微生物的检测：用压电免疫传感器检测食物及饮用水中的肠道细菌，其原理是将抗肠道细菌共同抗原的单克隆抗体固定在10 MHz的石英晶体表面，食物或水中的细菌浓度在一定范围内会引起石英晶体频率的明显改变，通过频率的变化可以测出肠道细菌的数量； (2) 病毒的检测：用压电免疫传感器检测艾滋病病毒(HIV)。将HIV人工合成肽固定于晶体表面，标本中若有抗HIV抗体，则会与肽链发生反应, 引起晶体频率改变； (3) 其他免疫检测：利用压电晶体的质量敏感性，在晶体表面固定一层生物敏感物质， 用于酶的直接检测和多种生物小分子物质的分析。,10.4 基 因 传 感 器 10.4.1 基因传感器的结构与类型 DNA探针是一段与待测的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)互补的核苷酸序列，DNA传感器是以DNA探针为敏感元
