《慢病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子受体1在未成熟树突状细胞的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子受体1在未成熟树突状细胞的表达（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、徐州医学院 硕士学位论文 慢病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子受体1在未成熟树突状细胞 的表达 姓名：晁亚丽 申请学位级别：硕士 专业：内科学（血液病学） 指导教师：黄一虹;徐开林 20090401 徐州医学院硕士学位论文 1 缩 略 词 表 Abbreviation 缩略词英文全称中文全称 Allo- BMTAllogeneic bone marrow transplantation异基因骨髓移植 APCAntigen presenting cell抗原递呈细胞 CDCluster of differentiation分化抗原簇 EGFPEnhanced green fluorescent pr
2、otein增强型绿色荧光蛋白 FCMFlow cytemetry流式细胞仪 FITCFluorescein isothiocyanate异硫氰酸荧光素 GM- CSFGranulocyte macrophage colony- stimulating factor 粒-巨噬细胞集落刺激因子 GVHDGraft- versus- host disease移植物抗宿主病 GVLGraft versus leukemia移植物抗白血病 ILInterleukin白细胞介素 imDCImmature dendritic cells未成熟树突状细胞 LPSLipopolysaccharide脂多糖 MH
3、CMajor histocompatibility complex主要组织相容性复合体 ODOptical density吸光度 PEPhycoerythrin藻红蛋白 RT-PCRReverse transcription-polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链反应 sTNFRSoluble tumor necrosis factor receptor可溶性肿瘤坏死因子受体 徐州医学院硕士学位论文 69 论文独创性声明 本论文 是我个人 在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中除了特别加以标注和致 谢的地方外不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果其他
4、同志对本 研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意 作者签名 日期 200 年 月 论文使用授权声明 本人完全了解徐州医学院有关保留使用学位论文的规定即学校有权保 留送交论文的复印件和电子文档允许论文被查阅和借阅学校可以公布论文的 全部或部分内容可以采用影印缩印或其它复制手段保存论文保密的论文在 解密后遵守此规定 作者签名 导师签名 日期 200 年 月 徐州医学院硕士学位论文 70 论文审阅认定书 研究生 在规定的学习年限内按照研究生培养方案的要求完 成了研究生课程的学习成绩合格在我的指导下完成本学位论文经审阅论 文中的观点数据表述和结构为我所认同论文撰写格式符合学校的相
5、关规定 同意将本论文作为学位申请论文送专家评审 导师签名 日期 200 年 月 徐州医学院硕士学位论文 2 慢病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子受体 1 在未成熟树突状细胞的表达 中 文 摘 要 目的 构建含有人可溶性肿瘤坏死因子受体 1 (sTNFR1) 的慢病毒表达载 体观察其在未成熟树突状细胞 (imDC) 中的表达为进一步研究 imDC 在骨髓 移植免疫耐受中的作用提供实验依据 方法 1. 以人外周血单个核细胞总 RNA 为模板RT-PCR 扩增出 sTNFR1 基因片段亚克隆至慢病毒转移质粒 pXZ208酶切并 DNA 测序验证正确后通 过 IRES 连接 EGFP 报告基因建立双顺反子
6、慢病毒转移质粒命名为 pXZ9- sTNFR1DNA 测序鉴定采用阳离子脂质体法将重组质粒包装质粒NRF 和 包膜蛋白质粒 pVSVG共转染 293 FT细胞根据报告基因 EGFP 测定病毒滴度 转染后 48 h 72 h 96 h 收集病毒上清获得携带 sTNFR1 基因的重组慢病毒 pXZ9-sTNFR12. 分离纯化 C57BL/6 小鼠的骨髓单个核细胞用含 20 ng/mL 重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF) 和 1 ng/mL 重组小鼠白细胞介 素-4 (rmIL-4) 的 RPMI 1640 培养液培养 7 d获得 imDC用脂多糖 (LPS) 刺激后 继续培养
7、 2 d光镜下观察细胞形态流式细胞术检测细胞表型用 pXZ9-sTNFR1 病毒上清感染 imDC同时以 pXZ9 病毒作为对照48 h 后流式细胞术评估感染 效率 RT-PCR 检测感染后 imDC 中 sTNFR1 的转录 Western blot法检测 sTNFR1 蛋白在 imDC 细胞和培养上清中的表达3. 观察骨髓来源的 DC 成熟过程中的表 型变化以及 sTNFR1 基因修饰 DC 的表型特征 本课题获江苏省自然科学基金 (07KJD320224) 资助 徐州市科技计划项目 (XM07C067) 资助 徐州医学院研究生科技创新计划项目资助 徐州医学院硕士学位论文 3 结果 1.
8、成功构建重组质粒 pXZ9-sTNFR1转染 293 FT细胞 12 h后在荧光 显微镜下观察到 EGFP 表达 48 h 72 h 和 96 h收集病毒上清 病毒滴度为 106 U/L 以上获得携带 sTNFR1 基因的重组慢病毒 pXZ9-sTNFR12. 流式细胞术检测 病毒上清对 imDC 感染效率达 (61.375.48) %RT-PCR 检测到 sTNFR1 的表达 Western blot 法检测到 sTNFR1 蛋白存在于感染后 imDC 细胞的培养上清中而对 照组未检测到 sTNFR1 的转录和表达3. 小鼠骨髓单个核细胞在培养 24 h 后大 部分贴壁生长仅见少量悬浮细胞约
9、 4 d 左右出现半黏附细胞集落集落逐渐 增多变大67 d 时细胞表面出现长短不一毛刺样突起第 5 d 的 DC 低表达 CD40 CD86 CD80 分子 几乎不表达 MHC类分子 第 8 d 时高水平表达 MHC 类分子和 CD40CD86 CD80 分子显示出成熟型 DC 的表型特征在外源 性 LPS 的刺激下sTNFR1 基因修饰可降低 DC 表面分子 CD40CD86 CD80 和 MHC类分子的表达 结论 1. 成功构建了负载 sTNFR1 基因片段及含 EGFP 报告基因的慢病毒载 体获得了高滴度的重组慢病毒颗粒2. 经慢病毒高效转导 imDC 后 sTNFR1 的 mRNA及蛋
10、白稳定地表达 sTNFR1 可以保护 imDC 不被外源性 LPS 刺激所活化 维持 DC 于非成熟型状态 关键词 未成熟树突状细胞可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰慢病毒 载体免疫耐受 徐州医学院硕士学位论文 4 The expression of human sTNFR1 in immature dendritic cells transfected by lentiviral vectors Abstract Objective To construct the lentiviral vectors carrying sTNFR1 gene and investigate its expre
11、ssion in infected immature dendritic cells for further study in immune tolerance after allogeneic bone marrow transplantation. Methods 1. The sTNFR1gene was amplified by RT-PCR from human peripheral blood mononuclear cells, after sequncing, subcloned to the lentiviral vectors pXZ208, ligated the sTN
12、FR1 and EGFP gene with IRES, construct the lentiviral vector called pXZ9-sTNFR1. Lentivirus were prepared by cotansfection 293FT cells with pXZ9- sTNFR1, and package plasmid NRF, envelope plasmid pVSVG using lipofectamine 2000. The titer of virus was monitored by the expression of EGFP. Supernatant
13、was collected after transfection at 48 h72 h and 96 h, and lentivirus carrying sTNFR1 gene named pXZ9-sTNFR1 were harvested. 2. Mononuclear cells were separated and purified from C57BL/6 mouse bone marrow cells were cultured with RPMI 1640 culture medium contained recombination mouse GM-CSF (rmGM-CS
14、F 20ng/mL) and recombination mouse IL-4 (rmIL-4, 1ng/mL) for 7 days, cultured cells were stimulated with LPS for additional 2 days, then dendritic cells were collected, the morphological and immunological phenotype of dendritic cells were indentified by optical microscope and flow cytometry (FCM) re
15、spectively. Next, we infected the immature dendritic cells with the collected lentivirus supernatant, pXZ9 lentivirus vector was used as contrast. The efficency of infection was evaluated by FCM at 48 h, the level of sTNFR1 in transfected immature dendritic cells was detected by RT-PCR, and the expr
16、essions of sTNFR1 in transfected immature dendritic cells and cuture medium were detected by the assay of Western blot. 3. Dendritic cells derived from bone marrow were modified or not with sTNFR1 gene, then changes of immunological phenotype were examed in the culture. This work was supported by the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (07KJD320224) and the Research Projects of Xuzhou (XM07C067). 徐州医学院硕士学位论文
