《干预FANCF基因及BCRP基因影响人乳腺癌细胞生长及耐药性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《干预FANCF基因及BCRP基因影响人乳腺癌细胞生长及耐药性的研究（82页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责 任。 论文作者签名： 益豳耸日期：型毖纽物 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科
2、大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：么茎型鲥 指导教师签名：肇旌虹 日 期：卫f 垒苎舀三! 理 四、 五、 j 一 、 中文论著摘要 干预F A N C F 基因及B C R P 基因影响人乳腺癌细胞生长及 耐药性的研究 刖吾 B C R P ( b r e a s tc a n c e l “ r e
3、 s i s t a n tp r o t e i n ) 与乳腺癌耐药性关系最为密切，但调 控机制不明确。范可尼贫血中F A B R C A 通路功能缺失可激活M A P K 系统，下调 B C R P 表达。F A N C F 作为F A B R C A 通路关键因子调控肿瘤细胞耐药性作用引起 学者关注，但乳腺癌中未见相关报道。课题组发现：乳腺癌细胞中F A N C F 基因 低失表达可干扰F M B R C A 通路生物学功能，降低B C R Pm R N A 表达及对阿霉素 的抵抗性；但乳腺癌细胞中F A N C F 调控B C R P 表达与耐药性是否通过M A P K 系 统尚需验
4、证。为此，本研究以F A N C F 和B C R P 同时作为切入点，构建F A N C F 基 因沉默及B C R P 过表达乳腺癌细胞模型；在体外水平检测不同基因特性细胞生长 表型、耐药性，分析F A N C F 基因沉默和B C R P 过表达使F A B R C A ，M A P K 通路 对化疗药物丝裂霉素( M M C ) 诱导的D N A 损伤的反应性和生物学功能的异同。 研究结果将为在乳腺癌药物治疗中，发现预防和或逆转耐药的新切入点和基因靶 点，提供理论与实验的依据。 实验方法 应用小提中量试剂盒提取质粒并进行基因测序，脂质体法转染人乳腺癌 M C F 7 细胞，M D A
5、M B - 4 3 5 S 细胞，R T - P C R 及W e s t e r nb l o t 检测翮( ，友B C R P 基因m R N A 和蛋白表达水平，确认干预F A N C F 和B C R P 细胞模型构建成功；F A N C F 基因沉默及B C R P 过表达并用丝裂霉素( M M C ) 作用后，分别采用M 1 Y r 法、流式 细胞仪J C 1 染色法及F I T C P I 双染法检测细胞增殖、线粒体膜电位及凋亡的改 变，采用T r a n s w e l l 小室法检测细胞迁移及侵袭力的改变以及彗星实验检测D N A 损伤情况等生物学特性的变化，采用流式细胞仪检
6、测细胞内阿霉素浓度变化。并 用W e s t e r nb l o t 检测B C R P ，F A N C D 2 及M A P K 通路相关因子的表达。 实验结果 1 M C F 7 和M D A M B 4 3 5 S 细胞在转染p S l i e n c e r 1 M 4 1C M 形翻 f C R ， 剐谢 质粒并在M M C 作用2 4 h 后，阳性转染组和阴性对照组相比，在生长表型方面： 细胞存活率，细胞线粒体膜电位，细胞侵袭力和迁移力显著下降( P 0 0 5 ) ，细胞内阿霉素浓度显著降低( P 0 0 5 ) E f f e c to f B C R P g e n eO
7、 V e re x p r e s s i o nc o u l dr e d u c et h ec o n c e n t r a t i o no fA d r i a m y c i n i nt w oc e l l s ( P 0 0 5 ) 。 1 ； 1 i 二 i l 。占? ；薰。 A 1 笔崩笔荆 笔崩鞠蚓 漤 ， ：，褥黪 鼍碜： 圣 飞 t 淄溯 - 。，灞黪： ：j ：， 澄 。“ 灞 嘲擎 ：# ”0 ：鼻 ：。o ；o ! 。i ： 飞 飞 ：翁秭 ：罗 文蛾 c R 州 图2 ，A n n e x i nv - F I T C P I 双染法检测M C F 7
8、 及M D A M B - 4 3 5 S 细胞M M C 处理 2 4 h 及4 8 h 后细胞凋亡情况 A 1 ，B 1 ，C 1M C F - 7 细胞，阴性转染及转染p S l i e n c e r 1 M 4 1a 形尉C B s J I l 尉姐 质粒，并用I C 5 0 浓度M M C 处理2 4 h 后细胞凋亡流式结果； A 2 ，B 2 ，C 2M D A M B - 4 3 5 S 细胞，阴性转染及转染p S l i e n c e r 谢4 1 C M 阮耐 ，C 丹，J l 删Z 质粒，并用I C 5 0 浓度M M C 处理2 4 h 后细胞凋亡流式结 果； A 3
9、 ，B 3 ，C 3M C F - 7 细胞，阴性转染及转染p S l i e n c e r 珈4 1C ? I 批剐C R ，J j l 尉吼 质粒，并用I C 5 0 浓度M M C 处理4 8 h 后细胞凋亡流式结果； A 4 ，B 4 ，C AM D A - M B 4 3 5 S 细胞，阴性转染及转染p S l i e n c e r 谢4 1 C M 阼翮 R ， 尉忧质粒，并用I C 5 0 浓度M M C 处理4 8 h 后细胞凋亡流式结 果。 表2 各组M C F 7 和M D A M B 4 3 5 S 细胞I C 5 0 浓度M M C 作用2 4 ，4 8 h 凋亡率
10、的 比较( x s 1 l 一) 5 M C F 7 柒t p S i l e n c e rC M V - F A N C F - s h R N A 的阳性转染组与阴性对照组，均用I C 5 0 浓度 M M C 作用2 4 h 后比较； 锚M C F 7 转染煳凹C ? 肌尉l ：B ，删的阳性转染组与阴性对照组，均用I C 5 0 浓度 M M C 作用4 8 h 后比较； * M D A - M B - 4 3 5 S 转染p S i l e n c e rC M 昨翻M = ! R ，| l l 删疆的阳性转染组与阴性对照组均用I C 5 0 浓度M M C 作用2 4 h 后比较
11、； * M D A - M B - 4 3 5 S 转染p S i l e n c e rC 彳阼刚N a ， l R ? 似的阳性转染组与阴性对照组均用I C 5 0 浓度M M C 作用4 8 h 后比较。 3 流式细胞仪J C 1 染色法检测尼懈基因沉默对人乳腺癌细胞 ( M C F 7 ，M D A M B 4 3 5 S 细胞) 加入M M C 后线粒体膜电位( M M P ) 的影响 由图3 中B 1 ，C 1 可以得出M C F 7 细胞转染p S l i e n c e r 刑4 1 C M 阼翻C R g 尉似质粒并用I C 5 0 浓度M M C 处理2 4 h 后与相同药
12、物处理的阴性 转染组相比线粒体膜电位显著降低( P 0 0 5 ) ；相同处理因素两细胞间 早期和晚期凋亡均无显著差异( 户 0 0 5 ) 。由图8 中B 3 ，C 3 可以得出l d C F - 7 细 胞转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 质粒并用I C s o 浓度M M C 处理4 8 h 后与相同药物处 理的阴性转染组相比早期和晚期凋亡无显著差异( 0 0 5 ) ；由图8 中B 4 ，C 4 可以得出M D A M B 4 3 5 S 细胞转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 质粒并用I c 5 0 浓度 M
13、M C 处理4 8 h 后与相同药物处理的阴性转染组相比早期和晚期凋亡也无显著差 异( 膨 0 0 5 ) ；相同处理因素两细胞间早期和晚期凋亡均无显著差异( 尸 0 0 5 ) 。 并用I C s o 浓度M M C 处理2 4 h 后细胞凋亡流式结果； A 2 ，B 2 ，C 2M D A M B 4 3 5 S 细胞，阴性转染及转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 质粒，并用I C 5 0 浓度M M C 处理2 4 h 后细胞凋亡流式结果； A 3 ，B 3 ，C 3M C F 一7 细胞，阴性转染及转染p c D N A 3 1 - B C R P
14、- c D N A 质粒，并 用I C 5 0 浓度M M C 处理4 8 h 后细胞凋亡流式结果； A 4 ，B 4 ，C 4M D A - M B 4 3 5 S 细胞，阴性转染及转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 质粒，并用I C s o 浓度M M C 处理4 8 h 后细胞凋亡流式结果。 5 l 表2 ，各组M C F 7 和M D A M B 4 3 5 S 细胞I C 5 0 浓度M M C 作用2 4 ，4 8 h 凋 亡率的比较( X s ，n - - - 4 ) o M C F 7 转染p c D N A 3 1 - B C R P -
15、c D N A 的阳性转染组与阴性对照组，均用I C s o 浓度删c 作用 2 4 h 后比较； 榭M C F 0 7 转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 的阳性转染组与阴性对照组，均用I C 浓度M M C 作用 4 8 h 后比较； M D A - M B - 4 3 5 S 转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 的阳性转染组与阴性对照组，均用I C 浓度 姗c 作用2 4 h 后比较； M D A - M B - 4 3 5 S 转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 的阳性转染组与阴
16、性对照组，均用I C 5 0 浓 度M M C 作用4 8 h 后比较。 9 流式细胞仪J C 1 染色法检测B C R P 基因过表达对乳腺癌细胞 ( M C F 7 M D A M B 4 3 5 S 细胞) 加入M M C 后线粒体膜电位( M M P ) 的影响 由图9 中B l ，C 1 可以得出M C F 7 细胞转染p c D N A 3 1 - B C R P - c D N A 质粒并用 I C 5 0 浓度M M C 处理2 4 h 后与相同药物处理的阴性转染组相比线粒体膜电位显著 升高( P 0 0 5 ) ；由图1 1 中B 2 ，C 2 可以得出M D A M B 4 3 5 S 细胞转染 p c D N
