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1、本科生毕业论文(设计)开题报告书题 目 人外周血B淋巴细胞的分离与激活 学生姓名 杨 正 学 号 08190148 专业班级 芙蓉生科0801班 指导老师 李 峰 教授2011年 9月 28日论文（设计）题目人外周血B淋巴细胞的分离与激活课题目的、意义及相关研究动态：课题目的：通过本论文的实施，熟悉和掌握人外周血淋巴细胞提取的一般方法，完成人外周血淋巴细胞的提取、鉴定及激活。研究意义及相关研究动态：淋巴细胞作为血液中白血胞的主要组成成分，是动物机体完成细胞免疫和体液免疫的重要基础，为抵抗外来侵害提供了完善的免疫防护机制。同时，淋巴细胞还具有寿命长，激活后可分裂、增殖的特性，因此很适合于离体培养
2、，为免疫学研究带来极大的方便。另外，利用体外培养的淋巴细胞进行抗癌研究、爱滋病治疗、新药研制已屡见不鲜。 分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，是进行各项细胞免疫检测的基础。分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要，不仅用于淋巴细胞总数测定，还可以用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类鉴定及各种淋巴细胞功能测定。分离得到的人外周血单个核细胞，用anti-CD40和 IL-4激活培养得到B淋巴细胞，激活的B淋巴细胞表面存在与NAP1相互作用配体。此实验为相关免疫学研究奠定了基础。课题的主要内容（观点）、创新之处：将分离得到的单个核细胞冷冻储藏或制成细胞悬液，用anti-CD40和
3、 IL-4激活培养得到B淋巴细胞，将B淋巴细胞与NAP1（FDC-SP）融合蛋白体外诱导培养，然后再进行相关实验的研究。分离PBMC是一项常规工作，传统的是采用Ficoll密度梯度离心法，Ficoll是一种粘性强的液体，其比重为1.077，在一定离心力的作用下，比重大于淋巴细胞的红细胞及多核粒细胞等沉淀于分离液的底层，单个核细胞在分离液的界面上。操作时需将抗凝血作适当稀释，比较适用于少量血液的分离，在血量较多时要分成数管进行离心，十分不便，而且重复多次地开放性操作也增加了污染机会。IL-4促进B细胞MHC类抗原、FcR/CD23和CD40的表达，并增强B细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量抗原刺
4、激发生免疫应答。增加FcR/CD23(IgE Fc 段低亲和力受体) 的表达，并释放可溶性CD23(sCD23)/IgE结合因子(IgE-BF)，与mIgE阳性细胞结合并诱导其分化，可能与促进细胞IgE的产生有关。研究方法、设计方案或论文撰写提纲：研究方法：1.分离B淋巴细胞高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。
5、分离人外周淋巴细胞以密度为1.0770.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.0761.090之间。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞，经洗涤、离心，重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95，淋巴
6、细胞约占9095，细胞获得率可达80以上，其高低与室温有关，超过25时会影响细胞获得率。 2.激活B淋巴细胞用含10小牛血清的1640完全培养液(含RPMI1640,Herpes 10mmolL,青霉素、链霉素各100UmL,10小牛血清)调整细胞数2X10mL,加入6孔板，每孔2mL，37 5C02培养箱培养6h，吸弃上清，用PBS轻洗2次，去除非粘附细胞，每孔加入含10%新鲜小牛血清的1640培养液2mL及细胞因子GM-CSF、IL-4(终浓度GM-CSF 100ngmL，IL-4 50ngmL)，置37 5CO2培养箱继续培养，每隔3d半量换液，加入全量细胞因子。每日在倒置相差显微镜下观
7、察，培养710d收集细胞并鉴定。设计方案：分离B淋巴细胞稀释血液：取抗凝脐带血5ml与等量Hanks液或RPMI1640充分混匀 配制离心分离液：吸取5ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45角，用移液器将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），应注意保持两者界面清晰 离心：在1820下，用水平离心机以2000r/min离心20min。离心后细胞分布（见图1、2），小心取出试管吸取单个核细胞：用移液器轻轻插到中层呈白色雾状的淋巴细胞层，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中 洗涤单个核细胞用Hanks液洗涤细胞2次，每次离
8、心1500r/min10min可去掉大部分混杂的血小板激活B淋巴细胞 外周血B淋巴细胞的分离，用anti-CD40和 IL-4激活B淋巴细胞不同活化阶段的B淋巴细胞与稳定转染 FDC-SP的小鼠成纤维细胞（L-cell）共培养流式细胞技术检测FDC-SP融合蛋白是否与B淋巴细胞结合论文撰写提纲：1.研究方案提出： 首先分离出B淋巴细胞然后再进行B淋巴细胞的激活B淋巴细胞分离采用方法：聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法B淋巴细胞激活采用方法：用anti-CD40和 IL-4激活2.如何选取适合的实验材料： 人脐带血加肝素抗凝剂3.采用合理的实验方法：3.1用聚蔗糖-泛影葡胺(
9、Ficoll-Hypaque)分离法可以成功地从人脐带血中提取单个核细胞(PBMC)3.2激活B淋巴细胞用anti-CD40和 IL-4激活B淋巴细胞4.对实验结果进行合理的分析完成期限和预期进度：完成期限：2012-05-15毕业论文 (设计)进度安排：2011-9-20 - 2011-10-15 收集资料，复习文献，撰写综述2011-12-01 -2012-03-30 进行外周血B淋巴细胞的分离与激活实验2012-04-01- 2012-05-15 撰写论文和毕业论文答辩主要参考文献与资料：1周琳琳.学士学位论文.湖南文理学院.2010年2FengLi, XuY.Yang, KaiT.Ya
10、o, et.al. Identification and characterization of a novel nasopharyngeal carcinoma-associated peptide, NAP-1. Journal of Translational Medicine，2004,2(1):103李峰，杨旭宇，姚开泰，等鼻咽癌相关基因NAP1的克隆及鉴定生物化学与生物物理进展，2004，31（5）：464-4694李峰，姚开泰，等应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质湖南文理学院学报（自科版）2008，20（2）：52-59 5李峰.成人视网膜假定蛋白基因ARHP和鼻咽
11、癌相关基因NAP1的克隆及功能研究.博士论文,中南大学2004.56李峰.激活的B淋巴细胞中NAP1（FDC-SP）特异性受体的分离与鉴定.湖南省自然科学基金课题7医学免疫学金伯泉主编，人民卫生出版社，2008 年8免疫学 周光炎主译，人民卫生出版社，2002 年。译自Roitt I Immunology, 6th ed.9免疫学原理周光炎主编，上海科学技术出版社，第1版，2007 年.10Cellular and Molecular Immunology 细胞和分子免疫学（影印版） 5th ed, Abul K.北京大学医学出版社,2004115th ed, Richard A. Golds
12、by, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne,W. H. Freeman and Company, New York,200612马树俊,邓鸿业,丁桂风,邓玉兰;人外周血两类单个核免疫抑制细胞的比较J;北京大学学报(医学版);1983年02期13叶本善;人脐带血淋巴细胞介导ADCC抗流感病毒感染细胞的能力J;国际免疫学杂志;1984年06期14聂慧芳，穆丽萍，刘宝庆，郝建珍;外周血单个核细胞冷冻保存配方的实验研究A;中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑C;1999年15北京医学院微生物学教研组编；实验免疫学J；北京：人民卫生出版
13、社;1980,435-43616王红祥，邵诗颖，李宾公，赵湜，唐晓琼，赵智刚，邹萍;人外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定，中国科学院上海冶金研究所; 材料物理与化学(专业);2000年17Nair SK, Snyder D , Rouse BT ,etal . Regression of tumors in mice vac 2 cinated with professional antigen - presenting cells pulsed with tumor extracts.Int J Cancer. 1997 ,70 :706.18Voohis WCV , Hair LS , Steinman RM and Kaplan G. Human dendritic cells. J Exp Med. 1982 ,155 :1172.19吴鹏，刘映峰，梁东辉，陈允钦；提高人外周血单核细胞分离率的方法探究，实用医学杂志2008年第24卷第5期.20 陈政良1,朱锡华2; 淋巴细胞识别与激活的双信号理论;1.第一军医大学免疫学教研室 ,广东广州 510515 ;2.第三军医大学免疫学教研室 ,重庆 400038.指导教师意见： 签名： 年 月 日
