《血管内皮细胞生长因子及其受体在乙型肝炎病毒相关性肾炎中表达及其意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管内皮细胞生长因子及其受体在乙型肝炎病毒相关性肾炎中表达及其意义（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、福建医科大学 硕士学位论文 血管内皮细胞生长因子及其受体在乙型肝炎病毒相关性肾炎中 表达及其意义 姓名：钟晓容 申请学位级别：硕士 专业：内科学（肾脏病学） 指导教师：庄永泽 20100401 福建医科火学2 0 0 7 级硕：L 研究生论文 血管内皮细胞生长因子及其受体 在乙型肝炎病毒相关性肾炎中表达及其意义 ( 中文摘要) 【目的】 1 、观察V E G F 、F l k 1 和T M 在乙肝相关性肾炎中的表达情况，探讨它们在H B V - G N 进展中的作用。 2 、观察I C A M 1 、V C A M 1 和T M 在H B V - G N 不同临床病理类型中的表达特点， 研究它
2、们在H B V - G N 发病中的作用。 3 、探讨携带H B V 无肾损害者和H B V - G N 患者H B V - D N A 阳性血清对体外培养 系膜细胞增殖及A T l R m R N A 、A T 2 R m R N A 表达的影响，并初步探讨其临床意义。 【方法】 1 、回顾性分析6 8 例H B V o G N 患者的临床病理资料，通过双盲法观察6 8 例 H B V - G N 患者肾组织血管病变情况，采用免疫组化方法检测肾活检组织中V E G F 、 F l k 1 、I C A M 1 、V C A M 1 和T M 的表达情况，并对其表达程度进行半定量评分，分 析其
3、变化与临床病理指标、血管病变的关系。 2 、以体外培养的人肾小球系膜细胞为对象，分别用健康人血清、携带H B V 无肾 损害者和H B V - G N 患者H B V - D N A 阳性血清刺激，采用噻唑蓝比色法( M 丌) 检测 各组系膜细胞增殖水平，逆转录一多聚酶链反应( R T - P C R ) 法检测各组系膜细胞 A T l R m R N A 、A T 2 R m R N A 的表达水平。 【结果】 1 、V E G F 和F l k 1 在H B V - G N 中的表达均明显高于正常对照组，且不同病理类型 中V E G F 和F l k 1 的表达有显著差异。T M 在H B
4、 V - G N 患者( S G N 除外) 肾小球毛细 血管表达增加，与正常对照组比较无明显差异。而S G N 组T M 的表达较正常对照组 及其他各种病理类型表达均下调。肾小球内V E G F 和F l k 1 两者表达呈正相关。在中、 重度病变组肾小球内V E G F 和F l k 1 的表达与肾小球病变评分呈负相关；T M 的表达 与。肾小球病变评分也呈负相关。在硬化组中V E G F 、F l k 1 和T M 的表达明显降低。硬 化组中肾小球内V E G F 和T M 的表达呈正相关，而非硬化组中二者无相关性。在中 重度血管病变组中V E G F 和F l k 1 的表达明显低于无
5、血管病变组。在轻、中度病变组 肾小球内V E G F 和F l k 1 的表达与患者2 4 小时尿蛋白定量呈正相关；在重度病变组 4 福建医科大学2 0 0 7 级硕士研究生论文 二者无相关性。肾小球V E G F 6 分，2 4 h 尿蛋白定量明显高于V E G F 2 分：重度。 3 实验方法 3 1 主要仪器 器材名称生产厂家 L e i c a 2 1 4 5 切片机德国L e i c a 公司 O L Y M P U L SB X 5 0 显微镜日本O L Y M P U L S 公司 O L Y M P U L S 显微镜数码相机系统日本O L Y M P U L S 公司 摊片烤
6、片机、隔水式恒温烤箱、多功能国产 振荡器、冰箱、高压锅 3 2 主要试剂 3 3 免疫组化步骤 ( 1 ) 3um 厚肾组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，水洗。 ( 2 ) 入己煮沸的0 0 1 MP H 6 0 柠檬酸盐修复液中高温高压修复( V E G F 和F l k - 1 高压 福建医科大学2 0 0 7 级硕上研究生论文 锅喷气1 r a i n 离开热源) ，自然冷却1 0 m i n 后，自来水冲洗至完全冷却，取出玻片，水 洗5 m i n 。 ( 3 ) 入3 过氧化氢水室温避光浸泡1 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶，P B S 浸洗3 m i n 3 。
7、 ( 4 ) 用免疫组化笔画圈，滴加封闭用正常羊血清，室温孵育1 0 m i n ，甩去多余液体， 滴加V E G F 抗体( 1 ：5 0 稀释) ，3 7 。C 隔水式恒温烤箱孵育3 h ；F l k 1 抗体( 1 ：2 0 稀释) ，冰 箱4 。C 过夜。 ( 5 ) 取出玻片，P B S 浸洗3 m i n X 3 。甩去多余液体，滴加聚合物增强剂，3 7 。C 隔水式 恒温烤箱孵育2 0 m i n ，P B S 液浸洗3 m i nX3 。 ( 6 ) 甩去多余液体，滴加酶标抗兔鼠多聚体，3 7 。C 隔水式恒温烤箱孵育3 0 m i n ，P B S 液浸洗3 m i n X
8、3 。 ( 7 ) 甩去多余液体，每张切片滴加新配制( 在1 0 m i n 内) 的A E C 显色液，显微镜下控 制显色程度，适当显色后即可用自来水轻轻冲洗中止显色，流水冲洗5 r a i n ，新鲜的苏 木精染色液复染细胞核，流水冲洗5 m i n ，水溶性封片剂滴封，3 7 隔水式恒温烤箱烘 干，中性树胶封片。各观察对象的每次切片均同时以P B S 缓冲液代替一抗作为空白对 照。 ( 8 ) 阳性结果判定：每张切片选1 0 个高倍视野( X 2 0 0 倍) ，根据染色程度及染色范 围来计算评分。a 染色程度：O 为阴性，1 为弱阳性( 低倍镜下可疑阳性，高倍镜下 明确阳性) ，2 为
9、中等阳性( 低倍镜下明确阳性) ，3 为强阳性( 低倍镜下强阳性) ；b 染色范围：0 分指无阳性染区；1 分为1 2 5 ；2 分为2 6 “ - 5 0 ；3 分为5 1 7 5 ；4 分为 7 5 。然后将染色程度的评分与染色范围的评分相乘除以视野数即为每 张切片的积分值，每组阳性总积分除以例数等于各组的平均阳性积分。 三、统计学分析 采用S P S S l l 1 统计软件包进行统计学处理，所有计量资料均采用7 + s 表示，多 组资料间比较，方差齐者，采用O n e W a yA N O V A 分析；方差不齐者，采用 K r u s k a l W a l l i s 分析，相关分
10、析采用S p e a r m a n 等级分析，以Q = o 0 5 作为检验水准， p O 0 5 ) 。根据。肾小 球V E G F 评分分为三组，V E G F 6 分1 6 例。肾小 球V E G F 6 分，2 4 h 尿蛋白定量明显高于V E G F 0 0 5 ) ，( 表1 6 ) 。 表1 - 6 肾小球中V E G F 表达与临床指标的关系( 了士s ) 1 7 福建医科大学2 0 0 7 级硕。 ：研究生论文 6 分 1 66 2 2 + 2 1 3 “7 0 2 0 + - - 3 2 6 4 5 ( 3 1 2 5 ) 注：与“分比较，謇P 2 分：重度。 3 、实验
11、方法 3 1 主要仪器 器材名称生产厂家 L e i c a 2 1 4 5 切片机 德国L e i c a 公司 O L Y M P U L SB X 5 0 显微镜日本O L Y M P U L S 公司 O L Y M P U L S 显微镜数码相机系统日本O L Y M P U L S 公司 摊片烤片机、隔水式恒温烤箱、多功能国产 振荡器、冰箱、高压锅 福建医科大学2 0 0 7 级硕一J ：研究生论文 3 2 主要试剂 3 3 免疫组化步骤 ( 1 ) 3um 厚肾组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，水洗。 ( 2 ) 入己煮沸的0 0 1 MP H 6 0 柠檬酸盐修复液中
12、高温高压修复( I C A M 1 、V C A M 1 和T M 高压锅喷气l m i n 离开热源) ，自然冷却1 0 m i n 后，自来水冲洗至完全冷却，取 出玻片，水洗5 m i n 。 ( 3 ) 入3 过氧化氢水室温避光浸泡1 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶，P B S 浸洗3 m i n 3 。 ( 4 ) 用免疫组化笔画圈，滴加封闭用正常羊血清，室温孵育1 0 m i n ，甩去多余液体， 滴加I C A M 1 抗体( 1 ：1 0 0 稀释) 、T M 抗体( 1 ：5 0 稀释) ，3 7 。C 隔水式恒温烤箱孵育3 h ； V C A M 1 抗体( 1 ：
13、2 5 稀释) ，冰箱4 “ C 过夜。 ( 5 ) 取出玻片，P B S 浸洗3 m i n X 3 。甩去多余液体，滴加聚合物增强剂，3 7 。C 隔水式 恒温烤箱孵育2 0 m i n ，P B S 液浸洗3 m i n 3 。 ( 6 ) 甩去多余液体，滴加酶标抗兔鼠多聚体，3 7 隔水式恒温烤箱孵育3 0 m i n ，P B S 液浸洗3 m i n x 3 。 ( 7 ) 甩去多余液体，每张切片滴加新配制( 在1 0 m i n 内) 的A E C 显色液，显微镜下控 制显色程度，适当显色后即可用自来水轻轻冲洗中止显色，流水冲洗5 m i n ，新鲜的苏 木精染色液复染细胞核，流
14、水冲洗5 m i n ，水溶性封片剂滴封，3 7 隔水式恒温烤箱烘 2 9 福建医科大学2 0 0 7 级硕士研究生论文 干，中性树胶封片。各观察对象的每次切片均同时以P B S 缓冲液代替一抗作为空白对 照。 ( 8 ) 阳性结果判定：每张切片选1 0 个高倍视野( 2 0 0 倍) ，根据染色程度及染色范 围来计算评分。( 1 ) 染色程度：0 为阴性，1 为弱阳性( 低倍镜下可疑阳性，高倍镜 下明确阳性) ，2 为中等阳性( 低倍镜下明确阳性) ，3 为强阳性( 低倍镜下强阳性) ； ( 2 ) 染色范围：0 分指无阳性染区；1 分为l “ - - 2 5 ；2 分为2 6 5 0 ；3
15、 分为 5 1 7 5 ；4 分为 7 5 。然后将染色程度的评分与染色范围的评分相乘除以视野数 即为每张切片的积分值，每组阳性总积分除以例数等于各组的平均阳性积分。 三、统计学分析 采用S P S S l l 1 统计软件包进行统计学处理，所有计量资料均采用i 士s 表示，多 组资料间比较，方差齐者，采用O n e W a yA N O V A 分析；方差不齐者，采用 K r u s k a l W a l l i s 分析，相关分析采用S p e a r m a n 等级分析，以Q = 0 0 5 作为检验水准， p 0 0 5 为有统计学意义。 结果 一、不同病理类型中I C A M 1
16、 、V C A M 1 和T M 的表达情况 I C A M 1 在正常对照组的肾小球和肾小管周围毛细血管有较强的表达，在肾小管 上无表达( 图2 1 ) ；在H B V - G N 患者肾小球和肾小管周围毛细血管中表达稍增加， 两者比较无统计学差异，而I C A M 1 在肾小管上的表达较正常对照组明显增加 ( P 0 0 1 ) 。其中，M C D 组肾小管上I C A M l 的表达明显低于M P G N 、M s P G N 、I g A N 及S G N 四组( P O 0 5 ) ，与M N 组比较无统计学差异( 图2 2 图2 7 ) 。V C A M 1 在 正常肾组织中无表达( 图2 8 ) ，在H B V - G N 患者肾小球内皮细胞微弱表达，肾小管 表达明显上调。其中，M P G N 组中肾小管上V C A M 1 的表达高于M C D 组( P 0 0 5 ) ， 而M N
