落新妇三萜酸A对HepG2细胞的抗肿瘤作用研究

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1、浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 分类号：分类号： 单位代码：单位代码： 10335 密密 级：级： 学学 号：号： 20917089 硕士学位论文 中文论文题目中文论文题目：落新妇三萜酸落新妇三萜酸 A 对对 HepG2 细胞的细胞的抗肿瘤抗肿瘤作用研究作用研究 英文论文题目：英文论文题目： Antitumor Effects of Astilbotrierpenic Acid A on HepG2 Cells 申请人姓名： 王娟娟 王娟娟 指导教师： 孙红祥 孙红祥 教授教授 陈慧华陈慧华 高级兽医师高级兽医师 专业名称： 兽医硕士兽医硕士 研究方

2、向： 天然 天然药药物物与与动物动物疾病防治疾病防治 所在学院： 动物科学学院 动物科学学院 论文提交日期论文提交日期 二零一二年一月二零一二年一月 浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 落新妇三萜酸落新妇三萜酸 A 体外体外对对 HepG2 细胞的细胞的作用作用研究研究 论文作者签名论文作者签名: 指导教师签名指导教师签名: 论文评阅人 1： 评阅人 2： 评阅人 3： 评阅人 4： 评阅人 5： 答辩委员会主席： 委员 1： 委员 2： 委员 3： 委员 4： 委员 5： 答辩日期： 浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作

3、用研究 ZHEJIANG UNIVERSITY Dissertation of master Antitumor Effects of Astilbotrierpenic Acid A on HepG2 Cells Master candidate: Juanjuan Wang Supervisor: Prof. Hongxiang Sun Senior Veterinarian Weihua Chen A Dissertation Submitted to Zhejiang University for Master Degree in the Field of Clinical Veter

4、inary Medicine Hangzhou China January, 2012 浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完

5、全了解 浙江大学浙江大学 有权保留并向国家有关部门或机构送交本论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 浙江大学浙江大学 可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 目录目录 摘要 . 1 Abstract . 4 主要缩略词 . 8 第一章 抑制肝癌 HepG2 细胞的分子机制研究进展 . 9 1 诱导凋亡 .

6、9 1.1 死亡受体途径 10 1.1.1 Fas (Apo-1/CD95) . 10 1.1.2 TNF-/TNFR-1 . 10 1.1.3 TRAIL . 11 1.2 线粒体途径 11 1.2.1 Bcl-2 family . 11 1.2.2 Ca2+ . 12 1.2.3 ROS . 12 1.3 相关凋亡因子 13 1.3.1 p53 . 13 1.3.2 UPP 13 1.3.3 TERT . 14 2 阻滞细胞周期 . 14 3 抑制肿瘤血管生成 . 15 4 降低侵袭转移力 . 16 5 逆转多药耐药 . 18 6 调控信号转导和转录因子 . 18 6.1 MAPK 通路

7、. 18 6.2 NF-B 19 6.3 Akt 19 6.4 c-Myc . 20 第二章 ATA 对 HepG2 细胞凋亡及细胞周期的影响 . 21 1 材料与仪器 . 23 1.1 仪器设备 23 1.2 主要试剂 23 1.3 供试药物 24 1.4 细胞培养 24 2 实验方法 . 24 2.1 MTT 法测定 ATA 对 HepG2 细胞增殖的影响 . 24 2.2 吖啶橙染色测定 ATA 对 HepG2 细胞形态的影响 . 25 2.3 JC-1 测定 ATA 对 HepG2 细胞线粒体跨膜电位的影响 . 25 2.4 FCM 测定 ATA 对 HepG2 细胞周期的影响 25

8、2.5 RT-PCR 法测定 ATA 对 HepG2 细胞基因表达的影响 . 25 浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 2.5.1 细胞孵育 . 25 2.5.2 RNA 的提取 26 2.5.3 cDNA 第一链的合成 . 26 2.5.4 PCR 引物的设计 26 2.5.5 PCR 反应体系及反应条件 27 2.5.6 琼脂糖凝胶电泳分析 . 27 2.5.7 电泳图片的获得和定量分析 . 28 2.6 统计学分析 28 3 结果 . 28 3.1 ATA 对 HepG2 细胞的抑制作用 28 3.2 ATA 诱导 HepG2 细胞凋亡 29 3.

9、2.1 细胞形态变化 . 29 3.2.2 线粒体跨膜电位降低 . 29 3.2.3 凋亡相关基因的表达 . 31 3.2.3.1 ATA 作用不同时间对 HepG2 细胞凋亡相关基因表达的影响 31 3.2.3.2 不同浓度 ATA 对 HepG2 细胞相关凋亡基因表达的影响 . 33 3.3 ATA 对 HepG2 细胞周期的影响 35 3.3.1 细胞周期分布变化 . 35 3.3.2 细胞周期相关基因的表达 . 35 4 讨论 . 38 第三章 PCR 芯片检测 ATA 作用 HepG2 细胞显著差异表达基因 . 42 1 材料与仪器 . 42 1.1 仪器设备 42 1.2 主要试剂

10、 43 1.3 供试药物 43 1.4 细胞培养 43 2 实验方法 . 44 2.1 PCR 芯片检测 ATA 对 HepG2 细胞基因表达的影响 44 2.1.1 Real-time PCR 芯片 44 2.1.2 细胞孵育 . 44 2.1.3 RNA 抽提 . 44 2.1.4 DNase I 消化 RNA 44 2.1.5 RNA 纯化 . 45 2.1.6 RNA 质量检测 . 45 2.1.7 cDNA 合成 . 46 2.1.8 实时定量 PCR 46 2.1.9 数据分析 . 47 2.2 RT-PCR 验证芯片结果 . 47 2.3 统计学分析 48 浙江大学硕士学位论文

11、落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 3 结果 . 48 3.1 PCR 芯片检测结果 . 48 3.1.1 RNA 的质量检测 . 48 3.1.2 PCR 芯片检测结果 49 3.2 RT-PCR 法验证芯片的结果 . 52 4 讨论 . 54 第四章 ATA 对 HepG2 细胞黏附、侵袭和转移力的影响 . 59 1 材料与仪器 . 59 1.1 仪器设备 59 1.2 主要试剂 59 1.3 供试药物 60 1.4 细胞培养 60 2 实验方法 . 60 2.1 黏附实验测定 ATA 对 HepG2 细胞黏附作用的影响 . 60 2.2 Transwell 实验测定 A

12、TA 对 HepG2 细胞侵袭力的影响 60 2.3 划痕损伤实验测定 ATA 对 HepG2 细胞转移能力的影响 . 61 3 结果 . 61 3.1 ATA 减弱 HepG2 细胞的黏附作用 61 3.2 ATA 抑制 HepG2 细胞的侵袭力 63 3.3 ATA 降低 HepG2 细胞的转移能力 64 4 讨论 . 65 结论 . 68 作者简介 . 69 致谢 . 70 参考文献 . 72 浙江大学硕士学位论文 落新妇三萜酸 A对 HepG2 细胞的抗肿瘤作用研究 1 摘要摘要 落新妇为虎耳草科植物落新妇 Astilbe chinese (Maxim.) Franch. et Sav

13、.的根茎，为较常 用的草药，广泛分布于我国南北各地区，资源十分丰富。民间俗称“黑芨” ，用以治疗各 种恶性肿瘤。本实验室以体外抗肿瘤实验为导向，从落新妇根茎中定向追踪筛选分离得到 5 个具有显著抗肿瘤活性的五环三萜类化合物，分别命名为 ATA、ATB 、ATC 、ATD 和 ATE， 其中以ATA活性最显著。 本课题研究发现， 与人宫颈癌HeLa细胞和人结直肠癌COLO 205 细胞相比，ATA 对 HepG2 细胞更为敏感。目前，对天然药物抗肿瘤的研究，已迈入 分子生物学的研究时代， 分子水平研究成果正逐渐揭开天然药物抗肿瘤作用的神秘面 纱，不仅为临床应用抗肿瘤中药提供充分的理论依据，而且为

14、天然药物抗肿瘤指明了 研究的方向。本课题为了深入地探讨 ATA 的抗肿瘤作用途径，选取 HepG2 细胞为研究对 象，先从诱导凋亡和阻滞细胞周期方面，分析 ATA 对 HepG2 细胞的抑制作用。随后，采 用美国 SA Biosciences 公司新一代功能性基因芯片 Human Cancer Pathway Finder PCR Array，从基因水平上全面地分析 ATA 作用 HepG2 细胞的显著差异表达基因，并采用 RT-PCR 对 PCR 芯片结果进行验证。同时，根据 PCR 芯片结果，进一步进行了 ATA 抗黏 附、抗侵袭和抗转移作用研究，并结合 PCR 芯片结果，深入地讨论 ATA 的抗肿瘤作用途 径。 1. ATA对对HepG2细胞凋亡及细胞周期细胞凋亡及细胞周期的影响的影响 采用MTT法测定了ATA对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用。结果显示，ATA能显著 抑制HepG2细胞的增殖，并呈浓度和时间依赖性关系。 细胞凋亡具有一系列典型的形态学特征和生化特征。本实验采用吖啶橙AO和JC-1染 色，荧光显微镜和流式细胞仪分析了ATA对HepG2细胞形态和线粒体跨膜电位的影响。结 果表明：HepG2细胞经ATA处理后，细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光，甚至可见 浓染的黄绿色荧光，并出