《研究生分子生物学实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《研究生分子生物学实验（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子生物学实验,颜景芝 2012.12,大鼠晶体B2蛋白基因 RT-PCR及转化噬菌体表达,实验一 RT-PCR 实验二 细菌的转化、重组子的筛选及 PCR鉴定转化产物 实验三 质粒的提取与纯化 实验四 SDS-PAGE对重组蛋白质的鉴定,主要内容,目的基因分离（RT-PCR，电泳鉴定）,酶切,目的基因与载体连接,重组体转入受体细胞,扩增、诱导表达,筛选阳性重组体,质粒提取 酶切电泳,PCR 电泳,SDS-PAGE (蛋白产物电泳鉴定),实验一 RT-PCR,今日主要任务(周一) 总RNA提取 RT-PCR 转化 铺平板,原理,RT-PCR包括三个主要步骤： （1）总RNA的抽提 （2）反转录
2、cDNA的合成 （3）PCR扩增,目的要求： 掌握RT-PCR的原理和方法,异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,1 总RNA的抽提,异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,(1) 如何保证RNA的完整性？,内源性RNA酶：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 外源性RNA酶：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。,新鲜细胞
3、：在其它因素没有问题的情况下，降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞,RNA降解和RNA的纯度,新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,冷冻样品：液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及
4、时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。,物理化学因素：低温，合适的pH值,取组织样品时要快速,RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase。28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。,RNA完整性的鉴定,蛋白质 核酸 OD260:OD280 100 0 0.57 95 5 1.06 90 10 1.32 85 15 1.48 80 20 1.59 75 25 1.67 70 30 1.73 65 35 1.78 60 40 1
5、.81 55 45 1.84 50 50 1.87 45 55 1.89 40 60 1.91 35 65 1.93 30 70 1.94 25 75 1.95 20 80 1.96 15 85 1.97 10 90 1.98 5 95 1.99 0 100 2,(2) 如何保证RNA的纯度？,单链的RNA的碱基中的共轭双键暴露的更多，在260nm处吸收的更多。,DNA: OD260/OD280 =1.8 RNA: OD260/OD280 =2.0,核酸的特征紫外吸收峰在260nm，蛋白质的特征吸收峰在280nm,260nm下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA或
6、RNA为40g/ml；寡核苷酸为20g/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。,质量好的RNAD260/D280在1.8-2.0之间，如果该值大于2.2，则认为RNA已经降解，最好不要再用了,OD260/OD280比值偏低,蛋白质污染：用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。,确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读 数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水
7、稀释样品：测 OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。 用水作为稀释液将导致比值偏低。,多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，需要 注意多糖、多酚杂质的去除。,（1）晶状体迅速放入匀浆器中，加RLT450 l，匀浆。 （2）向晶状体匀浆液中加入225l乙醇，枪头吹打，充分混匀。 （3）离心柱（EZ-10）放入2 ml 收集管中，将上一步混合液加入离心柱上，8000 rpm离心1分钟，弃去收集管中液体。（留柱子） （4）向离心柱上加500 l RW溶液，10000 rpm离心1分钟，弃去收集管中液体。,操作步骤：,（5）向离心柱上加500ul RPE溶液，10000r
8、pm离心1分钟，弃去收集管中液体。 重复步骤5一次。 （6）10000rpm离心2分钟，弃去收集管中液体。 将离心柱转移到新的无RNA酶的1.5ml 离心管中，向离心柱上加30-50ul去RNA酶水，50保温2分钟，10000rpm离心1分钟，收集物即总RNA。,加样枪的正确使用 离心机的正确使用 匀浆器的使用,注意事项,PCR：在体外由引物(primers)介导,利用酶促反应获得特异基因组DNA或cDNA的专门技术，又称基因扩增技术。 RTPCR：以mRNA为模板，用合适的含有目的基因序列的下游引物反转录成cDNA，在加入上游引物，进行PCR扩增。 RT：Reverse transcript
9、ion,2 RT-PCR,三个基本步骤,PCR的基本过程,变性(denaturation):双链DNA模板解开成单链,退火(annealing)：两个寡核苷酸引物结合到单链模板,延伸(extension)：沿着引物，根据碱基互补配对规律,9496，速度快，1min,退火温度依赖Tm(Tm-5),Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ,延伸温度一般72 ,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,逆转录酶（reverse transcriptase）,依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； Rnase水解活性：水解RNA/DNA杂合体中的RNA； 依赖DNA的
10、DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.,a、引物长度:一般为1530bp ，常用的是18-27 bp， 引物太短会影响PCR的特异性,引物的设计及其原则,引物的特异性决定PCR反应特异性。,引物设计原则的把握：,b、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。,c、引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。,e、产物不能形成二级结构。,f、碱基尽可能随机分布，,d、引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，,操作：,按照书P
11、5-6，循环数改为30个,琼脂糖凝胶电泳鉴定(明天),琼脂糖凝胶电泳的DNA回收,试剂盒,注意： 加大上样孔 UV照射下切胶，迅速,目的基因和载体的酶切,目的基因和载体的连接,DNA连接酶,限制性内切酶（双酶切）,3 转化,实验目的 (1) 学习转化的基本原理及方法。 (2) 验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解。,实验原理 转化（transformation）是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。,操作: 参见书P11,4 铺平板与涂平板,今日主要
12、内容（周二）,挑取单克隆菌落加至15 l LB培养基中混匀，取1 l进行PCR鉴定 前一天PCR产物的电泳鉴定 今天PCR产物的电泳鉴定 结果较好的，将剩余的菌液14 l转至6ml LB培养基中，过夜培养。,琼脂糖凝胶电泳,1. The electric charge effect（电荷效应）,2. The sieving effect （分子筛效应）,共价闭环 DNA,3. The concentration of agarose gel （琼脂糖凝胶的浓度）,PH（8.3） PI（4.04.5）, DNA -,EB（溴化乙锭）,是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的
13、DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号易于观察。 含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光， 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！,Operation,Weigh proper 0.3g agarose, dissolve in 30ml TBE buffer by heating in a microwave oven （称取琼
14、脂糖0.3克溶于30ml 1TBE buffer，微波炉加热熔化）,2. Gel bed can be made by sealing a proper sized plastic with the masking tape and inserted the comb （胶带封闭胶床，插梳子）,3. Cool agarose gel to 60, add 5l EB, mix, pour the agarose slowly (avoid bubbles) onto the gel bed （冷却，加EB混匀，倒入 胶床）,4. Let gel polymerize for about 30m
15、in, discard the masking tape, place the gel bed onto the electrophoresis tank, remove the comb （30min后，撕去胶带，放入电泳槽，拔出梳子),5. Fill the tank with proper amount of TBE buffer, usually the buffer is about 1 mm above the gel （加入TBE buffer，让液面略高于胶面）,6. Add 2l loading buffer and 7l sample onto a piece of parafilm, mixed, add DNA sample slowly with the pipette tip just beneath
