第二章体外细胞培养的基本要求

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1、第二章 体外细胞培养的基本要求,第一节 体外培养的生存条件,一、严格的无污染(无菌无毒)环境 无化学物质污染 无微生物污染 无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(抗体、补体等),二、合适的生存环境 恒定适宜的温度 细胞培养的的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受解剖部位体温差异的影响，如皮肤温度低于骨骼肌的温度。 大多数人和哺乳动物细胞系适合温度是3537；鸟类和禽类细胞温度要求较高，为38.5， 37 时生长缓慢；昆虫细胞的最佳生长温度为27；冷血动物的细胞系可耐受的温度范围较广(1526)。,细胞对低温的耐受比高温的耐受强，与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题，因此通

2、常将培养箱的温度设定为略低于最佳温度。 培养细胞置4下数小时后，恢复到37细胞仍能良好生长。 低温冷冻技术可长期保存细胞。,气相环境 细胞生存所需的气体主要有O2和 CO2 多数细胞缺O2不能生存，但高氧环境对细胞毒性作用较大。 由于培养基的pH值取决于溶解态CO2和碳酸氢盐HCO3-间的精密平衡，因此培养环境中二氧化碳含量的变化会改变培养基的pH值。 CO2主要维持培养液的pH，细胞代谢产生的CO2，释放至培养液使培养液变酸。为维持培养液pH值的恒定，常在培养用液中加入NaHCO3。, pH 大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH7.4，而且不同细胞系间差异极小。有些转化细胞系在轻度偏酸性的环

3、境(7.07.2)中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境(7.47.7)。昆虫细胞系最适pH值为6.2。总体而言细胞耐酸比耐碱强，在偏酸性环境中更有利于生长。,液相环境(渗透压)： 指各种平衡盐溶或培养液的等渗状态，细胞必须生活在等渗的环境中，不同细胞的理想渗透压不同。人血浆渗透压约290mOsm/kg，可视为培养人体的理想渗透压。对大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围均适宜。,三、合适的营养条件 营养成分：与体内基本相同，主要包括： 1. 氨基酸 所有细胞都需要以下12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨

4、酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸，这些氨基酸均为型。 此外，所有细胞都需要谷氨酰胺，谷氨酰胺在细胞代谢过程中具有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，也是合成磷酸腺苷所需的基本物质。,2. 单糖 主要为6碳糖，是细胞代谢的能量来源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，细胞对各种糖的吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。 3. 无机离子与微量元素：基本元素和微量元素，非培养液固定成分，实验研究中，通常加入不同微量元素，观察对培养细胞的影响。 4. 维生素：在细胞代谢过程中主要扮演辅酶、辅基的作用，必不可少。, 促生长因子及激素：主要来源于血清，对于维持细胞功能、保持细胞状态十分重要

5、。各种生长因子的作用明显并具有特异性，激素类物质也具有促进细胞生长增殖的作用。 促细胞贴附物质：体外贴附型细胞在生长过程中，多需要促细胞贴附物质，不同种类的促细胞贴附物质具有不同的促细胞贴附特性。,第二节 培养用液,培养用液主要包括： 营养液 缓冲液 平衡盐溶液 血清 消化液 pH调整液 抗生素,一、水和平衡盐溶液 培养用水： 体外培养细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。 配制培养用液应用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水。 通常不用去离子水，因含有机物和非离子物质。 制备的水存放时间不宜太长，一般不超过2周。,平衡盐溶液(Balance Salt Solution ，BSS) 主要由无机盐

6、、葡萄糖组成，主要作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH值稳定并提供简单的营养。多用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其它试剂等。平衡盐溶液的配制也需应用双蒸水或去离子水；若配方中含有 Ca2+、Mg2+，应当首先溶解，配制好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高压蒸气灭菌。,常用的BSS是Hanks液和Earle液： D-Hanks：NaHCO3量较少，缓冲能力较弱，宜利用空气平衡。 Earle液：含有高浓度NaHCO3，缓冲能力较强，需用5%CO2维持平衡。 注意： 配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无Ca 2+、Mg 2+的D-Hanks液 平衡盐溶液多配制成10贮存液。,二、培养液：

7、与培养基的含义几乎相同，英文均为medium，按来源分： （一）天然培养基(Natural Medium) 主要指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基，如血清、血浆、淋巴液及鸡胚浸出液等。含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、 pH等也与体内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大。,二. 培养液： 与培养基的含义几乎相同，英文均为medium，按来源分： （一）天然培养基(Natural Medium) 主要指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基，如血清、血浆、淋巴液及鸡胚浸出液等。含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、 pH等也与体内

8、环境相似，但制作过程复杂、批间差异大。, 组织浸出液：早期动物细胞培养中应用的天然培养基，主要成分为大分子蛋白(有利于细胞的分化)和小分子氨基酸(促细胞分裂增殖)，如鸡胚浸出液和牛胚浸出液等。 水解乳蛋白：为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基，可用于许多细胞系和原代细胞的培养。, 动物血清：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素以及无机物等。绝大多数动物细胞的培养需要使用动物血清。可起作用： 提供细胞生长和增殖所必须的基本营养物质如各种氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等。 补充基础培养液中没

9、有或量不足的营养成分，血清中含有多种激素和生长因子。, 促进细胞贴附的基质成分，如血清中的纤连蛋白和层粘连蛋白可促进细胞贴壁。 有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用，如硒、SeO3。 含蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞死亡时 释放蛋白酶的作用；血清蛋白形成了血清的黏度，可保护细胞免受机械损伤。 提供结合蛋白，携带重要的低分子量的物质，如白蛋白携带维生素、脂肪酸、胆固醇以及激素，转铁蛋白携带铁。,不足之处： 存在不利于细胞生长和繁殖的物质，如补体和免疫球蛋白。 血清成分不明确，影响结果分析。 不同动物，不同批次的血清成分和活性差别较大，造成培养结果不稳定。 有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清

10、可能促进某些细胞的生长（如成纤维细胞）同时抑制另一类细胞的生长（如表皮角质细胞）。 取材过程中有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞产生潜在的影响，导致实验失败或实验结果的不可靠性。,血清的质量标准： 血清质量的高低取决于两方面的因素：一是取材对象，二是取材的过程。血清质量的鉴定一般包括以下几个方面： 理化性质 如渗透压、 pH、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平以及内毒素等，其中球蛋白（主要是抗体）含量是一项非常重要的指标，含量越低血清质量越高，血红蛋白含量也是越低越好。 微生物检测 包括细菌、真菌、支原体和病毒等。 促生长效果 是血清最重要的特性之一，应以培养的细胞来检测。与标准对照血清比较。

11、,血清质量判断： 外观好的血清透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少量沉淀，较粘稠。如血清浑浊、不透明、多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白变性；若呈棕红色说明血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。如要进一步了解血清的内在质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞的生长状况。,血清的种类： 牛血清：胎牛血清 剖宫产的胎牛 新生牛血清 出生24h内 小牛血清 出生10-30天 人血清、马血清 鸡血清、兔和羊血清(同种细胞的特殊培养) 单牛血清、混合血清,选择牛血清的原因：来源充足，制备技术成熟、经过长时间的应用对其了解深入。 以GIBCO公司出售的牛血

12、清为例，胎牛血清取自剖腹产的胎牛，新生牛血清取自出生24h之内的新生牛；小牛血清取自出生1030天的小牛。胎牛未接触外界环境，血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少，因此胎牛血清的品质最高。,注意： 血清中补体成分对某些细胞有毒性作用，应56，30 min灭活。 血清长期保存应在-20以下。 分装成小瓶使用，避免反复冻融。 使用浓度： 合成培养基不加血清能维持细胞短期生存 维持液(25%血清) 细胞生长液(1020%血清) 不明成分对分析实验结果增加了困难 无血清培养基的应用。, 鼠尾胶原：从严格意义上讲不是一种培养基，不能够提供细胞生长所需要的营养物质，其主要作用是促进贴附型细胞的

13、贴壁，特别是对上皮型细胞。从动物特定组织中用人工方法提取，通常用大鼠尾腱制备。 制备方法：大鼠尾腱称重后剪碎按每克50ml的比例加入0.1%的醋酸溶液摇晃使尾腱分散于醋酸溶液中，4浸泡一周4000r/min离心1015min吸取上清即为鼠尾胶原，分装至小瓶，4保存备用。, 使用方法： 用吸管将胶原均匀涂于无菌的培养瓶细胞生 长面，胶原层不宜太厚，以没有液滴为准。 培养瓶通入氨气或用浸有氨水的棉球封口片 刻，氨气充于瓶内后用胶塞塞紧。 待胶原和氨气作用30min，胶原凝固，然后 用生理盐水或Hanks液冲洗，凉干后即可使用。,（二）合成培养基 是根据细胞在体内生存的条件，将细胞体外生长所需物质的

14、种类按一定量严格配制而成。最初研制合成培养基的目的，就是希望能完全替代天然培养基，但结果却没有象人们预期的那样。许多合成培养基只能维持体外培养细胞的短期生存，只有在添加适量天然培养基后，细胞才能在其中长期生长发育，同时发现原来针对某一种细胞研制的培养基也适合于许多其它细胞。,1. 基本成分 最低限量基础培养基(minimum essential media，MEM)只含有20多种细胞体外生长必不可少的基本成分，基本成分包括四大类物质： 无机盐：CaCl2, KCl, NaH2PO4 , NaCl, NaHCO3, MgSO4 氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、

15、苏氨酸、色氨酸 、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸 维生素：偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、核黄素、硫胺素、吡哆醛等 糖类：葡萄糖,2. 种类 几十种之多，常用的只有7、8种。 经典的Eagle MEM养基，仅含12种必需氨基酸、谷氨酰胺、8种维生素和必要的无机盐，成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。 DMEM（Dulbeccos modified Eagles medium）：为诺贝尔奖金获得者Dulbecco R.改良的Eagle培养基，多用于哺乳动物与人细胞系的培养。分为高糖型和低糖型。, RPMI-1640：最初是由Moor等为小鼠白血病细胞培养而设计，开始的配方特别适合悬浮细胞的生

16、长，主要针对淋巴细胞，经几次改良，从RPMI-1630、RPMI-1634，最后至RPMI-1640。其组分较为简单，后来发现适用于多种细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代细胞或传代培养的细胞，是目前应用最为广泛的培养基之一。, HamF12：使用了Cu2+、Zn2+和Fe2+等微量元素，适应在血清含量较低的情况下的细胞培养，有利于培养细胞的分化，也适用于克隆化培养。是无血清培养基中常用的基础培养基。 McCoys 5A 是一种专门为肉瘤细胞设计的培养基，后来发现它特别适合于原代细胞的培养以及较难培养细胞的生长。,3. 培养液的配制 认真阅读说明书，注意粉剂中不包含的成分， 主要是NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HE