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1、保加利亚乳杆菌的分离,第一组 组员：占小芸、王明振、 杨和敏、吴蕊意、桂方,课题,现提供一瓶酸奶（光明益生菌发酵乳），内有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，嗜酸乳杆菌，两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌。现分离出保加利亚乳杆菌，并制成斜面冰箱保存,保加利亚乳杆菌形态：菌体长约2-9um,宽约0.5-0.8um,呈单个体长杆状,不具运动性,也不会产生孢子。 培养特性：在牛奶上培养,菌落为无色到淡白色,通常呈不光滑状,直径1-3mm左右。生长需维生素B3和烟碱酸的帮助 培养：氧气需求方面,此菌为厌氧性,但在有氧状况下也可作用;酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热
2、,最适生长温度在37-45之间,对低温非常敏感。 能发酵的醣类有lactose（乳糖）,glucose葡萄糖）,fructose（果糖）,mannose（甘露糖）,sorbitol（山梨糖醇）等。,利用MRS琼脂培养基对保加利亚乳杆菌进行分离,分别挑取可疑菌落进行革兰氏染色,对镜检结果为革兰氏阳性菌,且细菌形状为杆状的菌种进行糖发酵试验生物化学鉴定.结论:在MRS琼脂培养基上,菌落较大、透明、灰白色,镜检细菌形状为杆状,麦芽糖和七叶苷发酵试验均为阴性,乳糖发酵阳性的菌种,即为保加利亚乳杆菌.,实验设计原理,试验流程,检样25ml样品+ 225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释
3、度的样品菌液,各取1ml分别涂布MRS琼脂培养基上,平板置于37CO2培养箱 培养23天,选取50300个菌落的 稀释度,挑取可疑菌落的 一半进行革兰氏染色,另一半接种于乳清琼 脂培养基,准备做生化 鉴定,将疑似菌落穿刺接种于五 种糖发酵半固体琼脂培养 基(麦芽糖、七叶苷、乳糖 蔗糖、葡萄糖),平板置于37CO2 培养箱培养23天,判断、制斜面、冰箱 保存,可疑菌落:菌落较大，透明，灰白色的为疑似菌落,1.1材料与设备,原料：酸奶、MRS琼脂培养基、乳清培养基、乳清、糖发酵培养基、化学试剂均为分析纯或生化试剂胰蛋白膏、酵母膏、酵母提取物、鱼肉蛋白胨、生化鉴定糖类（麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖、葡
4、萄糖） 设备及仪器：超净工作台、高压灭菌锅、CO2培养箱、显微镜 、培养皿、烧杯、电炉、试管、搪瓷杯、酒精灯、吸量管、试管架、电子天平、pH试纸、玻璃棒、恒温水浴箱、冰箱、接种环、接种针、量筒纱布脱脂棉等,1.2培养基的配置,MRS琼脂培养基的制备,配方：葡萄糖20、胰蛋白胨10、牛肉膏10、酵母提取物5、柠檬酸二铵2、磷酸二氢钾2、MgSO47H2O0.58、MnSO44H2O0.25、吐温80为1ml、蒸馏水1L、琼脂20 制法：将MgSO47H2O、MnSO44H2O葡萄糖以及吐温80以外的各成分溶解、冷却至50，以醋酸调节pH值为6.06.5而后加入MgSO47H2O、 MnSO44H
5、2O，最后加葡萄糖和吐温80，在121高温灭菌20min,2.乳清培养基的制备 配方：乳清500ml;蒸馏水500ml；胰蛋白胨5g；葡萄糖1g；酵母膏2.5g；琼脂粉20g；pH值为6.5. 制法：将上述各成分加热溶解于乳清中，调整pH为6.5，加入琼脂，加热溶解，115，高压灭菌20min，倾注平板 3.乳清的制备 称取乳清粉100g加入90的1L蒸馏水中溶解（先将水加热，而后加入乳清粉，以防糊底)。去68ml浓度为1mol/L的HCl倒入上述1L乳清粉液中，调节pH值至4.5左右（最好一次调成），保持9030min，使酪蛋白大量析出，凝结成块。用脱脂棉和纱布过滤出乳清，将乳清用浓度为1m
6、ol/L的NaCl调回pH值至6.5，而后煮沸，再用滤纸过滤，流通蒸汽灭菌30min备用。,4.糖发酵培养基的制备 配方：鱼肉蛋白胨5g，酵母提取物5g，胰蛋白胨5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，MgSO4, 7H2O为0.2g， MnSO4, 4H2O为0.2g，CaCO33g，吐温80为1ml，蒸馏水1L，质量分数为1.6溴甲酚紫，琼脂粉5g，麦芽糖（七叶苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖）10g。 制法：将MgSO4, 7H2O， MnSO4, 4H2O，麦芽糖（七叶苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖），吐温80以外的各成分溶解，冷去至50，以醋酸调节pH值至6.26.4，在121高压蒸汽灭菌2
7、0min,取酸奶25ml，放入无菌三角瓶中，加入无菌生理盐水225ml，充分溶解混匀。 从试管中取出1ml菌液，于另一试管中，再加入9ml无菌生理盐水。 如此稀释四次。5个试管分别按顺序记为1,2,3,4,5。 分别从5个试管中取出0.05ml菌液涂布于MRS琼脂平板，稀释菌液置于4冰箱备用， 平板置于37，在CO2培养箱中培养23d。 挑取可疑菌落的一半进行革兰氏染色。 另一半分纯种接种于乳清琼脂培养基，准备做生化鉴定 取麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五种糖发酵半固体培养基，分装试管，高度约为45。 用接种环以无菌操作从纯培养于乳清琼脂培养基的疑似菌种穿刺接种。 置于37下CO2培养箱中
8、培养23d 挑取纯种的保加利亚杆菌于含有培养基的试管中，并制做成斜面发在适当的条件下进行保藏。,实验步骤,试验中使用了5个菌液稀释度（102,103,104,105,106）进行涂布，目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长出50300个菌落的稀释度为最佳。 生化鉴定的结果是：乳糖发酵试管中培养基由紫色变为黄色者，其余4种糖发酵培养基均未变色的菌落。,生化鉴定结果,3 结论,将实验结果与鉴定流程和生化特性对照，可以得出：利用MRS培养基分离出的菌种，表现为菌落较大、透明、灰白色，镜检细菌形状为杆状，麦芽糖和七叶苷发酵试验均为阴性。乳糖发酵为阳性的菌种，即为保加利亚乳杆菌,实验用品的依据,MRS琼脂培养基的选择:当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，如稳定的温度（37C）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、较高的相对饱和湿度（95%），来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。,
