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1、佳木斯大学 硕士学位论文 肝硬化门脉高压症肝细胞线粒体结构及酶学改变与肝储备的关 系 姓名：丁隆 申请学位级别：硕士 专业：外科学 指导教师：罗维;刘伟新 20040701 佳木斯大学硕士研究生毕业论文 一、中文摘要 目的探讨肝硬化病人不同c h j l d P u g h 级别间的肝细胞线粒体的体 视学变化，从而评价其在肝储备功能的评估及临床治疗中的意义。 方法本研究按体视学原理和方法，在电镜下随机摄片，以细胞质为参照 空间，分别对8 例正常人及3 0 例不同肝功级别的病人的肝细胞线粒体的 体积密度( V v ) 、表面积密度( S v ) 及比表面( 心v ) 进行了测量，并用 直线相关的
2、统计学方法研究其与血清转氨酶、血清总胆红素及脾细胞线 粒体间的关系。 结果与正常对照组相比，肝硬化存活组病人，踅肝：力能分级的下降，肝 细胞线粒体的各项体视学参数均显著下降( P 0 0 5 ) ，并在c h n d 哪肝功级别间存在交错现象； 在A 级、B 级的存活组与死亡组间，差异存在显著性( P 0 0 5 ) ；线粒体的S v 在 C h i l d - - P u g h A 级与C h i l d - - P u g h B 级之间存在显著性 P 0 0 5 ) i 线粒体 的R s v 在C h i l d - - P u g h B 级与C l l i l d P u 曲A 级
3、及正常对照组之间差异存 在显著性( P O 0 5 ) 。 在肝硬化病人死亡组之间线粒体V v 及R s v 各组阈比较均无统计学 意义，s v 仅在C h i l d - - - P u g hB 级与C h i l d - - P u g hC 级问差异存在显著性 矗木斯大掌硕士研究生毕业论文 ( P O 0 5 ) 。( 见表3 ) 表3 脾细胞线粒体的体况学测量结果 纽刖 例数体积密度( V v )表面积密崖( S v ) 比表面( R s v ) 对照组 A存活组 级 死亡1 1 ：【 B存活组 级死亡组 C存活组 01 6 8 0 士0 0 4 17 02 0 I7 土00 4 I
4、3 0 I6 10 士00 5 0 5 01 8 5 6 士00 6 3 2 02 9 4 0 士0 0 7 0 2 03 I2 8 - f - 0I2 39 03 4 3 5 士0 0 3 3 4 0I4 6 8 士00 4 6 9 02 4 4 9 土00 5 I2 02 I6 0 士0 0 3 4 9 I8 4 5 8 士00 32 0 l7 4 0 0 土02 2 9 9 0 10 4 0 士00 2 7 3 14 0 32 土0 3 1 4 2 01 9 3 0 - f - 00 3 6 4 级死亡组 5 1 8 6 4 7 0 2 3 4 215 2 7 6 04 7 3 0 1
5、9 1 4 4 03 6 7 4 24 佳木斯太掌硕士研究生毕业论文 七、讨论 线粒体是细胞内有氧呼吸和供能中心，极易受到病理因素的损害， 肝硬化肝细胞受损伤时，线粒体首当其害，而其体积、面积的变化及形 态改变往往是细胞功能受损的最早反映J 。因此我们可以从形态定量变 化推测肝脏功能的改变 4 3 “。本实验既是通过对线粒体形态学的研究束 揭示其与肝功能的关系。 1 肝硬化肝细胞线粒体与肝储备功能 正常隋况下，线粒体电子传递链反应提供了所需能量的9 5 左右， 完成这些生物氧化的酶与辅酶也主要分布在线粒体嵴与内膜上。肝硬化 肝细胞线粒体受损时，其在形态上主要表现为嵴断裂和内膜的损伤。进 而导致
6、参与生物氧化的酶与辅酶的数量降低，影响了细胞的氧化磷酸化， 最终使A T P 的生成减少，肝脏能量代谢障碍，这又影响了肝硬化病情的 发展，两者互为因果关系。主要机制为：( 1 ) 缺血缺氧：肝硬化肝脏组 织间有纤维间隔形成，并从汇管区向中心静脉延伸。它跨跃肝实质，形 成大小不等的结节，即假小叶，在假小叶内形成两到三层细胞组成的肝 细胞板层，从而使肝细胞血管表面积与肝窦面积之比的绝对值下降F 】。另 外由于纤维组织的沉积并同时伴有微循环的改变，形成了肝内分流的形 态学基础。此外，肝硬化还可并发肝肺综合征而引起低氧血症。上述各 种原因造成肝细胞缺血缺氧，而线粒体对缺氧极为敏感。此时，线粒体 呼吸链
7、电子传递受到干扰，氧分子接受电子产生氧自由基，氧自由基又 返过来作用于线粒体的双层磷脂层生物膜，破坏其中的不饱和脂肪酸发 生脂质过氧化反应：不饱和脂肪酸破坏；o 脂质过氧化反应主要产物 M D A ( 丙二醛) 与膜上蛋白的游离氨基酸或磷脂分子缩合成无生物活性 的大分子产物。这些均使膜的流动性下降，通透性增加。而呼吸链上的 电子传递过程和偶联磷酸化过程又信赖于呼吸链成分在内膜中的侧向扩 散和膜流动性。因此，膜流动性下降及通透性增加又使氧化磷酸化功能 受损，能量生成障碍。线粒体功能受损时，又通过单价渗漏( u I l i v a l e n tl e a k ) 佳术斯大掌硕士研究生毕业论文 产
8、生更多的0 2 。从而造成肝细胞的损害；( 2 ) 钙失调：丁F 常情况下，细 胞内总钙量的7 0 8 0 存在于线粒体。线粒体对胞浆c a l 浓度的调节 有重要作用。肝硬化时，缺氧、感染、内毒素等损伤因素可引起细胞膜 破坏和膜上C a ”一A T P a s e 受抑，细胞外高浓度C a 2 + 顺化学梯度大量涌人， 线粒体代偿性摄人c 扩。线粒体内膜上存在着直径为2 0 A ( 2 n m ) 的c a 。 依赖性小孔【1 。该小孔具有非选择性通透作用。c a 2 十的摄入常俘随线粒 体膜的去极化和旷的排出，还有线粒体内c d + 浓度的增加，当c E + 摄入 过量时，这些因素均促使内
9、膜小孔开放，其结果线粒体膜对离子通透性 升高，c J + 流入胞浆，线粒体膜电位降低和氧化磷酸化的脱偶联。钙稳 态失调通过下列途径引起肝损伤：C a 2 + 激活与肝细胞膜有关的磷脂酶， 产生溶血卵磷脂和花生四烯酸引起生物膜结构的破坏，o C a 2 十激活蛋白 酶，使黄嘌岭脱氢酶变为黄嘌呤氧化酶促进氧自由基生成：o C a 2 + 激 活c a 2 + 一A T P a s e 。使线粒体摄入过量C a 2 + ，导致A T P 能量耗竭：c a 2 + 激活核酸内切酶引起D N A 断裂。 在本实验通过对8 例正常人肝组织及3 0 例不同C K l d P u 出级别病人 的肝组织的形态学
10、分析，得出：病肝线粒体体视学参数与肝功能 c l l i l d - P u 曲分级间有一定的对应关系。即随肝硬化病人病变程度的加重， 肝功分级下降，线粒体体积密度( V v ) 、表面积密度( S v ) 、比表面( R “) 值逐渐减小，这在死亡组表现尤为明显。因为线粒体体积密度( V v ) 反 映单位体积内线粒体的体积，与线粒体的体积、数量和大小有关；表面 积密度( S v ) 反映平均单位体积内线粒体表面积的大小，与线粒体的数 量、大小、形状有关：比表面( R s v ) 表明其与周围环境的接触程度，线 粒体的比表面大反映进出线粒体的底物较多，物质交换较频繁，线粒体 的功能旺盛p 引
11、，反之，功能减弱。根据以上体视学参数的定义，并结合 本实验可知：上述指标的减少表明线粒体内外膜及嵴膜面积的明显减少， 肝细胞线粒体通过生物氧化过程产生能量的功能剧烈下降，通过上述发 生机制影响肝硬化病情的发展。周晓军通过肝穿刺活检证实：肝硬变时， 线粒体体密度较低，在非活动性肝炎肝硬变组降低明显。本实验资料结 果与其相似研究结果一致。 然而，本实验结果也表现出在同一肝功能C h i l d P u 曲级别病人的肝 佳术斯大掌硕士研究生毕业论文 细胞线粒体各项参数并不一致。死亡组与存活组之间，表面积密度( S v ) 、 体积密度( V v ) 差异呈显著性变化( P 0 0 5 ) ，与线粒体
12、的各指标间也无相 关性。这与上述的报道相一致。 本实验在胆红素测量上得出：A 级、B 级存活组与正常对照组比较， 三组组间差异均有显著性( P 0 0 1 ) ，死亡组间C h i l d P u g hB 级与 C h i l d - - P u g hC 级间却无统计学意义，而二者与C h i l d - - P u g hA 级死亡组 间却有显著性( P o 0 5 ) 。与线粒体的各项体视学参数亦无相关性。分析 产生该实验结果的原因：胆红素产生后需经肝细胞内的葡萄糖醛酸基转 移酶的作用与葡萄糖醛酸酯化后经肾排泄。肝脏在胆红质代谢中具有摄 2 8 佳术斯大学硕士研究生毕业论文 取、结合和
13、排泄功能。因此血中胆红素的含量在很大程度上与肝细胞功 能密切相关，然而，胆红素代谢易受代谢途径中其它环节的影响，这也 大大影响了其评价肝储备功能的准确性与敏感性。 3 肝硬化与脾脏 肝硬化是我国常见的疾病和主要死亡原因之一，I 临床上以肝功能受 损和门脉高压为表现。由于门脉压力升高导致脾脏血液回流受阻，脾脏 瘀血肿大，继而发生脾功能亢进。表现为脾脏肿大，血中一种或数种血 细胞成分减少。有关脾功能亢进的发生机理至今仍不清楚，目前仍停留 在三种学说阶段：脾内阻留学晚、脾激素学说、抗体学说。( 1 ) 脾内阻留 学说：脾肿大时脾血池容积扩大，脾内红细胞池、白细胞池和血小板池 占循环内相应血细胞总量的
14、比例较正常脾增加5 5 2 0 倍，尤以血小板池 增加最显著，这与临床上脾亢时血小板减少常常最早出现、也最明显是 一致的。脾内阻留学说认为脾亢血细胞减少是因为其在脾内阻留，被吞 噬细胞破坏所致。( 2 ) 免疫学说：肝硬化时免疫功能紊乱，机体 产生多种血细胞自身抗体，其中与脾亢关系最密切的是血小板 相关抗原( P A I g G ) ，P A I g G 是结合在血小板膜表面糖蛋白 上的一类血小板自身抗体，主要由脾脏产生，在肝硬化脾亢病人明显 升高【“。结合有( P A I g G ) 的血小板流经脖脏时，在抗体的介导下易 被巨噬细胞捕获和吞噬。( 3 ) 激素学说：脾亢时脾脏可能产生某些激素
15、，抑 制骨髓造血功能和加速血细胞的破坏或阻止其进入血循环。 近年来也有学者进行了一系歹哺q 研究证实，脾脏在肝硬化的发生、 发展中有一定的作用。陈双等研究发现【4 “，以四氯化碳和乙醇诱发大鼠 肝硬化门静脉高压，在诱发前切除脾脏可明显缓解肝硬化的发展，肝细 胞受损程度和炎性细胞浸润程度轻，假小叶形成延迟，肝硬化发生率低。 即使在肝硬化过程中切除脾脏仍有部分缓解作用。相反，在未切除脾脏 者肝内炎性细胞浸润及肝细胞损伤程度重，纤维组织增生明显，假小时 形成早。表明脾脏参与了肝硬化的病理过程。也有学者报告，用硫酸钠 诱发大鼠肝硬化过程中，保留脾脏者肝硬化程度远较切除脾脏者重。且 发现脾切除组肝胶原酶
16、活性明显高于不切除脾脏组。此外储脂细胞( r r 0 ) 是肝纤维化时肝内产生细胞外基质的主要细胞，肝纤维化是细胞外基质 佳木斯大掌硕士研究生毕业论文 增生与降解失衡的结果。而储脂细胞的激活也是线粒体损伤，产生氧自 由基，激活脂质过氧化作用的结果。前述实验中发现脾切除组大鼠肝内 I T O 细胞数量较未切除脾脏组明显减少。因此我们分析肺脏可能在肝细 胞线粒体的损伤中发挥一定作用，主要通过下述途径，脾功能亢进时， 由于红细胞的破坏增多，加之营养不良等因素，使血红蛋白含量下降， 从而加重了肝细胞的缺氧，但这并不意味着可以用脾脏的功能来反映肝 细胞线粒体的损伤程度。本实验结果显示：脾线粒体各项体视学参数的 变化在不同肝功能级别的病人间并无明显的规律性，且与肝细胞线粒体 体视学参数无相关性，分析原因：虽然脾脏可能参与了肝硬化的某些发 病过程，对肝硬化的预后有一定影响，但脾脏也只不过在某些发病环节 对肝硬化产生不利的因素，且在肝硬化的发病过程中脾亢的程度与肝功 的损伤程度并不一致，故不能用脾功能的情况来评
