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1、2019/10/23,1,脆性X染色体综合征,中南大学湘雅医院产前诊断中心 龙志高,2019/10/23,2,脆性X染色体综合征（Fragile X Syndrome),脆性X综合征（MIM:309550）是种发病率仅次于先天愚型的遗传性智力低下综合征，发病率占全部儿童的0.05%,呈X连锁遗传,占X连锁智力低下的40%。其外显率因性别不同有差异，男性80，女性30。,2019/10/23,3,临床表现,男性患者： 智力障碍、行为异常、语言反复，还有青春期大睾丸、颜面狭长、前额及下颌突出等体貌特征。,2019/10/23,4,女性患者： 由于女性有两条X染色体，异常X染色体随机失活，故其智力低
2、下程度较轻，多有行为及情感异常，体征亦不如男性患者明显。,2019/10/23,5,*Kenneson A , Warren ST. Semin Reprod Med , 2001 ,19 (2) and Monnier - Barbarino P , Forges T. J Gynecol Obstet Biol Reprod ( Paris) , 2002 ,31 (4),前突变： 一般前突变携带者不出现症状，但最近研究表明，女性携带者可能出现卵巢功能可能不正常，携带者女性有较高的出生双生子倾向,也可能有早熟卵巢衰竭( POF) 和过早绝经*。,2019/10/23,6,最新的研究确认，一
3、些老年的前突变携带者中有进行性的严重震颤和行走平衡困难等症状，一般是一些脆性X染色体综合征的患者的祖父。称这种疾病为脆性X染色体相关震颤/共济失调综合症 Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS),2019/10/23,7,虽然该疾病是与脆性X染色体综合征完全不同的一种神经性疾病，且患者也完全不同，但两种疾病都是由同一基因引起，因此对了解该基因的功能有重要意义。,2019/10/23,8,孤独症： 确诊的孤独症患儿中有大约4%6%是由脆性X染色体综合征引起 有三分之一的脆性X染色体综合征患儿有孤独症 脆性X染色体综合征是已知的引起孤独
4、症的最常见原因 任何孤独症患者都应当进行脆性X染色体综合征检查。,2019/10/23,9,脆性X染色体综合征产生的机制,1943年Martin和Bell于伦敦首次报道了这种X连锁的智力低下家系，即发现两个智力正常的兄弟通过其各自健康的女儿出生了个具智力低下与宽大脸庞和下颌的儿子 1969年Lubs在低叶酸培养基中发现了长臂末端具随体样结构的X染色体。 1977年Sutherland证明了这个罕见的叶酸敏感脆性部位FRAXA位于Xq27.3。 1991年Verkerk等用定点克隆技术在Xq27.3附近发现了脆性X智力低下基因FMR1 细胞遗传学的脆性部位是FMR1基因突变的个直接的细胞学标记，
5、是因为(CGG)n大量扩展和甲基化干预了DNA的复制和染色质缩合，或两者共同作用所引起。,2019/10/23,10,95以上的脆性X综合征发病的分子遗传学基础是FMR1基因(CGG)n结构扩增的动态突变。 5以下是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构导致的。,2019/10/23,11,normal controls (N) premutation carriers (P) full mutation patient (F),2019/10/23,12,FMR1基因的结构,The FMR1gene, depicting the K-protein homology
6、(KH) domains and the Arg-Gly-Gly triplet (RGG) box, involved in RNA binding, the nuclear localization signal (NLS), transporting the protein into the nucleus, the nuclear export signal (NES; the consensus sequence LRLERLQID is indicated), exporting the protein from the nucleus, and coiled coil (CC)
7、domains, involved in proteinprotein interactions. In addition, the I304N missense mutation found in a single, most severely affected patient is indicated.* * R. Frank Kooy, Rob Willemsen and Ben A. Oostra， MOLECULAR MEDICINE TODAY, MAY 2000 (VOL. 6),2019/10/23,13,脆性X染色体综合征的检查,细胞遗传学的检查 是确定诊断的重要方法。通常在
8、低或无叶酸和胸腺嘧啶的培养基中培养待诊者的标本。据Yunis报道，5-氟氧尿苷和咖啡因相继处理可使Fra(X)表达率增高，但大量实验证明，即使在最理想的培养条件下，也不可能在带脆性X染色体的所有中期细胞分裂相中均能发现Fra(X)染色体，通常不超过50%,2019/10/23,14,在脆性X染色体综合征的家系中，男性患者绝大多数有Fra(X)表达，表达率为2-60%；正常表型的男性也可有Fra(X)阳性，成为正常表型的男性传递者 女性杂合子中，一种为智力低下者，有Fra(X)表达，其表达率可达741%；另一种为智力正常的携带者，常无Fra(X)表达，即使有表达者，表达率低于5%,2019/10
9、/23,15,女性中FRA(X)表达率与智力低下程度呈正相关，与年龄呈负相关，男性中无这种相关关系 Fra(X)的表达有遗传异质性，即在某些家系的表达率高于另一些家系。,2019/10/23,16,2019/10/23,17,2019/10/23,18,FRAXA附近存在多个脆性位点： FRAXE(Xq28) FRAXF(Xq末端) FRAXD(Xq27.2) Xq26 在观察时应仔细区分,2019/10/23,19,分子遗传学检查,DNA 连锁分析 RFLPs 连锁分析已逐步由应用二核苷酸序列进行家系连锁分析所取代。FMR1 基因两侧有3 个二核苷酸重复序列FraXAC1、FraXAC2、D
10、XS548 可作为遗传指标。 优点：对于DNA样品量少，又无法重新获取的产前诊断病例和成员众多大家系的筛查，可以用这种连锁分析方法缩小检测范围，简化调查过程。 缺点：脆性X综合征的遗传方式非常复杂，具有与一般遗传病完全不同的特殊遗传规律：（1）前突变母亲传给子女时（CGG）n有扩展趋势；（2）前突变父亲，父女传递时（CGG）n有缩减趋势;（3）全突变女性传男性后代时（CGG）n有扩展趋势，传女性后代时（CGG）n有缩减趋势。所以连续分析不能确切反映（CGG）n扩展的数量。,2019/10/23,20,Souhern 印迹杂交法 应用Southern 印迹杂交即基因组DNA 经双酶酶切与基因内探
11、针StB12. 3 等杂交,分析杂交后DNA 片段大小,可了解(CGG) n 重复数,以及CpG岛甲基化程度来诊断携带者及患者。此法是目前诊断FraX 的主要方法,2019/10/23,21,a) 230 to 780 repeats in case 1 (and 130 in one laboratory) b)26 to 32 repeats in case 2c)51 to 76 repeats in case 3 (and 130 in one laboratory)* *The final report of EMQN 2004 External Quality A-ssessmen
12、t scheme for FRAX testing,2019/10/23,22,该法需同位素标记,技术繁杂费时,且存在同位素污染问题,不易于基层推广应用,亦不宜于群体筛查。使用时还应注意酶解完全,否则产生的杂交带可致错误的诊断。近年来用地高辛标记引物进行Southern 印迹杂交取得了很大进展,不仅快速而且避免了同位素污染* *Gold B , Radu D , Balanko A , et al . Mol Diagn , 2000 ,5 (3),2019/10/23,23,PCR 法 Fu 等人最先将PCR 法用于(CGG) n重复拷贝数的检测。应用(CGG) n 重复序列两侧引物直接扩增
13、包括(CGG) n 重复区域在内的DNA 片段,其产物经琼脂糖或变性序列胶电泳分离,转印后与同位素或非同位素标记的寡核苷酸探针杂交,可检测扩增产物;也可用银染方法直接检测PCR 产物,即可精确测定重复拷贝数;还可在PCR 反应体系内掺入同位素标记的某种脱氧单核苷酸(如32P - dCTP) ,再经变性序列胶电泳分离,放射自显影得到PCR 产物但当重复拷贝数超过200 ,扩增就较困难,2019/10/23,24,PCR 不仅能够快速简便地确定(CGG) n 拷贝数,而且采用多对引物可以检测FMR - 1 基因的缺失和点突变,RT- PCR 可检测FMR - 1mRNA ,了解基因的表达情况,20
14、19/10/23,25,Wang 等还利用CpG岛两侧引物通过PCR 方法扩增CpG岛邻近区域来判断CpG岛甲基化状态 将基因组DNA 先经甲基化敏感性酶充分酶切后再进行PCR 扩增。正常男性CpG岛未甲基化,模板DNA 可被切割而检测不到PCR 产物,男性患者CpG岛存在异常甲基化,故该位点不能被甲基化敏感性酶识别而扩增出一固定大小的PCR产物 此法能诊断男性患者,适用于对FraX 男性患者的确诊及群体筛查,但不能鉴别正常男性及正常男性传递者,且这类个体基因组DNA 经上述酶切不完全时也可产生假阳性。为防止酶解不全造成假象,所有阳性标本均应用Souhern印迹杂交进一步验证。因女性有一条X染
15、色体本身就已存在甲基化,故不使用于女性标本的检测,2019/10/23,26,转录水平的检测 Pieretti 等研究发现绝大多数FraX男性患者有FMR - 1 mRNA 表达,少数男性患者体内因CpG岛不完全甲基化而有少量表达* Feng 等还通过Northern 印迹杂交、RT- PCR 等在对正常及前突变等位基因的研究中发现,二者在FMR - 1 mRNA 转录过程、表达水平及稳定性等方面极为相似,因而推测前突变携带者不表现临床症状可能与mRNA 转录水平正常密切相关* 检测mRNA 水平有助于FraX患者的诊断及表型的预测 * Pieretti M,Zhang FP , Fu YH
16、, et al . Cell , 1991 ,66(4) * Feng Y, Lakkis L , Devys D ,et al. Am J Hum Genet ,1995 ,56(1),2019/10/23,27,蛋白水平的检测 Willemsen等（1995）发明了一种单克隆抗体快速诊断方法，只需12滴血制成涂片，自然干燥，多聚甲醛固定，纯甲醇处理，以磷酸盐缓冲液洗涤，然后与鼠单克隆抗体孵育，以链亲和素-生物素碱性磷酸酶系统显色，24小时内即可出结果。* * Willemsen R , Smits A , Mohkamsing S , et al . Hum Genet ,1997 ,99(3),2019/10/23,28,该法简便、经济、快速、相对无创伤。不仅可以诊断出由于(CGG) n 的扩增导致的FraX患者,还可以检测出由于缺失、点突变导致FMR - 1基因不表达的患者,适用于群体筛查 因女性患者体内有一定比例的活性X染色体,具有全突变的女性患者(尤其成年女性) 其白细胞的正常染色体有优先活跃的倾向,大多数淋巴细胞的FMRP 降
